一、原理

人外周血小淋巴細(xì)胞，通常都處在G1期（或G0期），一般情況下不進(jìn)行分裂。如在培養(yǎng)液中加入植物血凝素（PHA），這種小淋巴細(xì)胞受到刺激可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，進(jìn)入有絲分裂。短期培養(yǎng)后，經(jīng)秋水仙素處理，低滲和固定，即可得到大量的有絲分裂細(xì)胞。人體的1ml外周血內(nèi)一般含有約1×106~3×106個小淋巴細(xì)胞，足夠染色體標(biāo)本制備和分析之用。

二、用品和試劑

1. 5ml注射器（7號針尖），培養(yǎng)瓶、刻度吸管，需15磅滅菌20分鐘。離心管、吸管、量筒、載玻片，經(jīng)洗液按常規(guī)清洗、烘干備用。

2. 超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，天平，離心機(jī)、顯微鏡等。

3. 試劑：

（1）RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液，并加入NaHCO3 2.0克/1000ml以緩沖pH。*溶解后經(jīng)0.22 μm滅菌濾膜抽濾除菌。

（2）肝素鈉（肝素）：稱取0.2g溶于100ml雙蒸水中，濃度為0.2%，15磅20分鐘滅菌。

（3）秋水仙堿（秋水仙素〕，生理鹽水配制成10μg/ml濃度，15磅20分鐘滅菌，分裝，置-20℃。

（4）低滲液：0.35%KCl。

（5）固定液（Carnoy固定液） 甲醇∶冰乙酸（3∶l），臨時配制。

（6）Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸緩沖液，臨時配制。

（7）磷酸緩沖液：1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等體積混和。

（8）5% NaHCO3滅菌濾器抽濾備用。

三、操作步驟

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

1. 培養(yǎng)基的配制：

在超凈工作臺中，100ml培養(yǎng)基含以下成分和比例：

RPMI-1640 84ml

小牛血清 15ml

PHA 3支

肝素鈉 1ml

卡那霉素 終濃度為100單位/ml

以5% NaHCO3（無菌）或1N HCl調(diào)pH至7.2-7.4.

用刻度吸管將培養(yǎng)液分裝入培養(yǎng)瓶（10ml/瓶），4℃?zhèn)溆谩?/span>

2. 采血：酒精消毒皮膚，肘靜脈采血0.3-0.5ml,立刻將注射針直接穿過培養(yǎng)瓶的橡膠塞，向10ml培養(yǎng)基中注入30-40滴全血，輕搖勻后置37℃恒溫箱培養(yǎng)。

3.培養(yǎng)：時間為68小時。培養(yǎng)期間，定期輕搖勻，使細(xì)胞充分接觸培養(yǎng)基。

4. 秋水仙素處理：終止培養(yǎng)前2-4小時，在培養(yǎng)液中加入秋水仙堿（用1ml注射器5號針尖滴加2滴，使終濃度為0.07μg/ml）。

以上步驟均需無菌操作

（二）染色體制備

1. 收集細(xì)胞：將培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入潔凈離心管中，以1000rpm離心8-10分鐘，棄上清液。

2. 低滲處理：向刻度離心管中加入預(yù)溫37℃的低滲液8ml,用滴管混勻，置37℃恒溫水浴中低滲15-25分鐘。

3. 預(yù)固定：低滲后加入0.5ml固定液，輕輕混勻后1000rpm離心8-10分鐘。

4. 一固定：棄上清液，加入5ml固定液，輕輕混勻，靜置20分鐘。1000rpm離心，棄上清液。

5.二固定、三固定：同一固定。

6. 制懸液：棄上清液后，視細(xì)胞數(shù)量多少加入適量固定液制成細(xì)胞懸液。

7. 滴片：吸取細(xì)胞懸液自10-20cm高滴在一張干燥潔凈的載玻片上，輕吹散，氣干。

8. 染色：1:10 Giemsa染色5-10分鐘，細(xì)水洗去多余染液，氣干。

9. 鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，油鏡下觀察染色體形態(tài)并計(jì)數(shù)。

四、注意事項(xiàng)

1. 培養(yǎng)溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在37±0.5℃，培養(yǎng)液zui適合pH為7.2-7.4。

2. 秋水仙素處理時間過長，分裂細(xì)胞多，染色體短?。环粗?，則少而細(xì)長。都不宜觀察形態(tài)及計(jì)數(shù)。故秋水仙素的濃度及時間要準(zhǔn)確掌握。

3. 低滲使紅細(xì)胞膜破裂，淋巴細(xì)胞膨脹，低滲處理濃度及時間要適當(dāng)。且低滲后混勻細(xì)胞一定要輕，否則引起膜破裂、染色體散失。

4. 離心前配平，離心速度過高，細(xì)胞團(tuán)不易打散；反之，細(xì)胞易丟失。

5. 固定液應(yīng)在使用前臨時配制。

6. 載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。