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如何從組織中分離制備細(xì)胞核基質(zhì)/中間纖維支架結(jié)構(gòu)？
材料與儀器
新鮮組織
NaCl 緩沖液 細(xì)胞骨架緩沖液
Teflon 研杵 Doume 勻漿器
步驟
1. 在 4℃ 將新鮮組織切成 1 mm3 左右的小塊。在 4℃，用 Teflon 研杵和 Doume 勻漿器在含 0.5% Tritron X-100 的細(xì)胞骨架緩沖液中對(duì)切碎的組織進(jìn)行勻漿，直到?jīng)]有可見的團(tuán)塊。每克組織用大約 10 ml 緩沖液。
含 0.5% Triton X-100 的細(xì)胞骨架緩沖液：
10 mmol/L PIPES，pH 6.8
300 mmoI/L 蔗糖
100 mmoI/L NaCI
3 mmol/L MgCl2
1 mmol/L EGTA
2. 用一 250 μm 孔徑的尼龍濾器過(guò)濾勻漿?；|(zhì)成分和沒(méi)有充分勻漿的團(tuán)塊將留在濾器上。
3. 在 4℃ 用抽提緩沖液抽提 3~5 分鐘。
抽提緩沖液：
10 mmol/L PIPES，pH 6.8
250 mmol/L 硫酸銨
300 mmol/L 蔗糖
3 mmol/L MgCl2
1 mmol/L EGTA
4. 在含 0.5% Triion X-I00 的消化緩沖液中用無(wú) RNA 酶的 DNA 酶消化以去除染色質(zhì) DNA 酶濃度為 200~400 單位/ml，32℃ 反應(yīng) 30~50 分鐘。
含 0.5 % Triton X-100 的消化緩沖液：
10 mmol/L PIPES，pH 6.8
300 mmol/L 蔗糖
50 mmol/L NaCl
3 mmol/L MgCl2
1 mmol/L EGTA
5. 用抽提緩沖液清洗樣品 5 分鐘。
6. （可選）樣品在 4℃ 用 2 mol/L NaCl 抽提 3~5 分鐘。這一步能使可能形成核基質(zhì)核心的 10 nm纖絲分支顯形（Jackson and Cook 1988; He et al, 1990)。在第 4 步中用 Hae Ⅲ 和 Pst Ⅰ（每種酶400 單位/ml）代替 DNA 酶 Ⅰ 可以使核心纖絲保存的更好。
2 mol/L NaCl 緩沖液：
10 mmol/L PIPES，pH 6.8
300 mmol/L 蔗糖
2 mol/L NaCl
3 mmol/L MgCl2
1 mmol/L EGTA
7. 固定核基質(zhì)以進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)或電子顯微鏡檢測(cè)。
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