流式樣品中不可能*去除死細(xì)胞，而在流式分析時(shí)又不希望有死細(xì)胞的干擾，所以如何在流式分析和流式分選時(shí)明確分辨死細(xì)胞就成為流式細(xì)胞術(shù)的一個(gè)重要研究內(nèi)容。目前，有四種方法供流式分析者區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞。
活細(xì)胞能產(chǎn)生非特異性熒光，只是非特異性熒光信號相對于熒光素發(fā)射的熒光信號較弱。死細(xì)胞也可以產(chǎn)生非特異性熒光，而且死細(xì)胞產(chǎn)生的非特異性熒光要明顯強(qiáng)于活細(xì)胞，有的甚至強(qiáng)于熒光素產(chǎn)生的熒光信號。非特異性熒光產(chǎn)生的熒光波長沒有選擇性，并不是局限于某一熒光波長范圍，而是處于連續(xù)的波長范圍，所以一般所有的熒光通道都能夠接收到死細(xì)胞產(chǎn)生的非特異性熒光信號，而且其在所有波長范圍的熒光強(qiáng)度相差不多，各個(gè)熒光通道接收到的死細(xì)胞的熒光強(qiáng)度都是處于同一個(gè)等級的。在散點(diǎn)圖上死細(xì)胞是位于對角線上的，而且不同的死細(xì)胞，其非特異性熒光的強(qiáng)度不同，且差異可能很大，強(qiáng)度大的可能是強(qiáng)度小的幾十倍，甚至幾百倍。所以從整體來看，死細(xì)胞的非特異性熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出從低到高的連續(xù)性分布，表現(xiàn)在散點(diǎn)圖上死細(xì)胞剛好處于對角線上，如圖A所示呈線型，與活細(xì)胞群體的圓形分布有明顯區(qū)別。流式分析者可以根據(jù)死細(xì)胞的這一特點(diǎn)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。死細(xì)胞位于散點(diǎn)圖的對角線上，但是對角線上的細(xì)胞卻并不一定都是死細(xì)胞，因?yàn)殡p陽性細(xì)胞如果在x軸和y軸的熒光信號相似時(shí)，也可以位于對角線上。所以，散點(diǎn)圖對角線上的細(xì)胞可能是死細(xì)胞，也可能是雙陽性細(xì)胞，但是這兩種細(xì)胞的形狀是不一樣的，死細(xì)胞呈現(xiàn)連續(xù)的線型分布，而雙陽性細(xì)胞群呈現(xiàn)圓形的群體分布，可以從對角線上的細(xì)胞群體的形狀大致判斷細(xì)胞的性質(zhì)。圓形的雙陽性細(xì)胞群和線型的死細(xì)胞群有時(shí)相互重合在一起，這時(shí)依靠散點(diǎn)圖無怯區(qū)分雙陽性細(xì)胞和死細(xì)胞。如圖B所示，樣品細(xì)胞為正常小鼠脾臟細(xì)胞，標(biāo)記FITC抗CD3抗體和PE抗CD4抗體，FITC和PE雙陽性的CD4+T細(xì)胞與死細(xì)胞也在一起，無法區(qū)分。
如上所述，死細(xì)胞的非特異性熒光強(qiáng)度可以與熒光素產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度類似，所以不能根據(jù)熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱去區(qū)分該熒光信號是來自于死細(xì)胞的非特異性熒光還是來自于熒光素產(chǎn)生的熒光，但是可以利用在散點(diǎn)圖上死細(xì)胞位于對角線的特點(diǎn)來區(qū)分死細(xì)胞和陽性的活細(xì)胞。散點(diǎn)圖可以同時(shí)反映兩個(gè)熒光通道的信息，如果X軸代表的通道是標(biāo)記的熒光素接收通道，而y軸代表的通道是不標(biāo)記熒光素的通道，即閑置熒光通道，這時(shí)死細(xì)胞和X軸代表的熒光素陽性細(xì)胞在X軸的熒光信號可能相同，單從這個(gè)熒光通道信號無法區(qū)分，但是可以從散點(diǎn)圖中細(xì)胞y軸信號的大小來區(qū)分，死細(xì)胞的X軸和y軸熒光信號相似，位于對角線上，而陽性細(xì)胞y軸代表的信號是陰性的，X軸代表的信號是陽性的，位于散點(diǎn)圖的右下區(qū)域，即位于對角線死細(xì)胞的右下方，死細(xì)胞和陽性活細(xì)胞可以被明顯區(qū)分。如圖C所示，X軸表示FITC通道（樣品細(xì)胞標(biāo)記有FITC抗CD3抗體）、y軸表示APC通道（閑置通道），借用該散點(diǎn)圖可以明確區(qū)分圖B中無法區(qū)分的死細(xì)胞和雙陽性細(xì)胞。此時(shí)只需將排除了死細(xì)胞后的CD3+T細(xì)胞設(shè)門，將門內(nèi)的細(xì)胞顯示于新的FITC-PE散點(diǎn)圖中，如圖D所示，此時(shí)該散點(diǎn)圈內(nèi)的細(xì)胞都是活細(xì)胞，因?yàn)闃悠芳?xì)胞同時(shí)標(biāo)記有PE抗CD4抗體，所以圖中的細(xì)胞明顯分為兩群，雙陽性的是CD4+T細(xì)胞，單陽性的是CD8+T細(xì)胞。7AAD(7氨基放線菌素D）是一種經(jīng)典的核酸標(biāo)記染料，在流式細(xì)胞術(shù)中能夠代替PI染料用于標(biāo)記死細(xì)胞，以去除死細(xì)胞對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。PI染料被激發(fā)后發(fā)射的熒光波長范圍很大，常規(guī)FL1、FL2,FL3都能夠接收到其熒光信號，所以與FITC和PE熒光素發(fā)射的熒光波長有很大程度的重疊，因此，PI染料不宜與FITC和PE共標(biāo)記。而同樣標(biāo)記核酸的7AAD，其發(fā)射的熒光波長比較集中，一般被PerCP熒光通道接收，基本不與FITC和PE發(fā)射的熒光重疊，可以與FITC和PE共同標(biāo)記樣品細(xì)胞。所以，7AAD在標(biāo)記死細(xì)胞方面要明顯優(yōu)于PI染料。7AAD的熒光信號被PerCP通道接收，所以7AAD不能與PerCP或PE-Cy5偶聯(lián)的抗體共同標(biāo)記樣品細(xì)胞。標(biāo)記7AAD不需要與其他熒光素偶聯(lián)抗體同時(shí)標(biāo)記，只需在流式上樣前5min加入適量的7AAD于流式管中，就可上樣分析。分析時(shí)將PerCP通道陰性的細(xì)胞設(shè)門顯示于新的流式圖中即可，此時(shí)流式圖中的細(xì)胞都是7AAD陰性的活細(xì)胞。（3）PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性細(xì)胞PE-Cy5通道（通常是FL3，接收的熒光波長范圍大致為655-685nm)有時(shí)可用于識別死細(xì)胞，但首先該通道必須是閑置通道，即樣品細(xì)胞中沒有標(biāo)記該通道代表的熒光素（PE-Cy5、PerCP等）偶聯(lián)抗體。選擇PE-Cy5-SSC散點(diǎn)圖，一般可看到不成群的PE-Cy5陽性細(xì)胞，這些陽性細(xì)胞的SSC值也是散在分布的，這些散在的PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性細(xì)胞一般都是死細(xì)胞，如下圖所示。PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性細(xì)胞，即圖A中的設(shè)門部分，將這部分細(xì)胞設(shè)門顯示于FITC-PE散點(diǎn)圈中，如圖B所示，這部分PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性細(xì)胞基本都位于對角線部分，而對角線細(xì)胞一般就是死細(xì)胞，所以，散在的PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性細(xì)胞一般就是死細(xì)胞。利用PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性細(xì)胞區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞時(shí)，流式圖分析的順序一般是先在FSC-SSC圖中選擇目標(biāo)細(xì)胞所在的細(xì)胞群，將其設(shè)門，然后將門內(nèi)的細(xì)胞顯示于PE-Cy5-SSC散點(diǎn)圈中，排除PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性細(xì)胞代表的死細(xì)胞，將PE-Cy5陰性細(xì)胞設(shè)門，然后將門內(nèi)的細(xì)胞顯示于新的流式圖內(nèi)分析，這時(shí)該流式圖內(nèi)的細(xì)胞都是活細(xì)胞，分析或者分選時(shí)就可以盡量排除死細(xì)胞的干擾了。但是，這種排除死細(xì)胞的方法只是一種經(jīng)驗(yàn)方法，一般在實(shí)驗(yàn)要求不高或者預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)使用，PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性細(xì)胞并不一定都是死細(xì)胞，死細(xì)胞也并不一定都位于PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性區(qū)域內(nèi)，其陰性區(qū)域內(nèi)也可能有一定比例的死細(xì)胞。所以，流式分析者可以借鑒這種方法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞，但是不能將此方提作為區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)，7AAD標(biāo)記法才是標(biāo)記死細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)。（4）EMA與ViD標(biāo)記死細(xì)胞只標(biāo)記分析活細(xì)胞的表面抗原分子時(shí)，用7AAD鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞是理想且經(jīng)典的方法。但是如果分析胞內(nèi)分子，如檢測胞內(nèi)的重要抗原分子、胞內(nèi)細(xì)胞因子和胞內(nèi)活化的激酶等都需要先固定樣品細(xì)胞，然后用打孔劑在細(xì)胞膜上打孔，使熒光素偶聯(lián)抗體能夠通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與相應(yīng)目標(biāo)分子結(jié)合，這時(shí)7AAD就無怯鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞了。如果在固定細(xì)胞前標(biāo)記7AAD，固定和打孔的過程可能會使7AAD發(fā)射熒光的能力丟失，如果在上樣前標(biāo)記7AAD，那所有的細(xì)胞都會被標(biāo)記，因?yàn)?/span>7AAD也可經(jīng)過小孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與DNA結(jié)合。這時(shí)，就可以用EMA(ethidiummonoazaide)和胺反應(yīng)性活性染料(aminereactiveviability dye,ViD)代替7AAD在分析胞內(nèi)分子時(shí)用于鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。EMA與PI和7AAD一樣也是一種能夠與DNA結(jié)合的熒光染料，但不能自由通過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞死亡細(xì)胞膜通透性增加時(shí)就可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合。EMA比PI和7AAD穩(wěn)定，標(biāo)記胞內(nèi)分子時(shí)的固定和打孔操作不會影響EMA發(fā)射熒光信號的能力，在固定前標(biāo)記EMA就可排除死細(xì)胞的影響。但是，EMA只有暴露在紫外條件下才能夠與DNA共價(jià)結(jié)合，而且EMA的熒光信號較弱。ViD是一種新型鑒定活細(xì)胞和死細(xì)胞的熒光染料，它與EMA一樣穩(wěn)定，固定和打孔的操作不會影響其發(fā)射熒光的能力，在分析胞內(nèi)分子時(shí)，固定前標(biāo)記ViD可鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞，而且其標(biāo)記過程簡單，熒光信號也較強(qiáng)，具有較好的應(yīng)用前景。
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