免疫親和層析技術(shù)使用單克隆抗體或經(jīng)過(guò)親和層析純化的多克隆抗體。在某些情況下，可用未純化的多克隆抗體，但一般不使用混合的單克隆抗體。

1. 應(yīng)用多克隆抗體進(jìn)行免疫親和層析

使用多克隆抗體進(jìn)行免疫親和層析有一定的局限性，因?yàn)槎嗫寺】贵w通常結(jié)合抗原分子上的多個(gè)表位，雖然親合力高，但洗脫困難。當(dāng)一種抗原與多種不同的抗體結(jié)合后，需要很苛刻的洗脫條件，通常會(huì)損壞抗體層析柱，至少也會(huì)使部分抗原變性。在這種情況下，每種抗原和抗體相互作用的洗脫條件不同，故難以建立有效的洗脫條件。應(yīng)用多克隆抗體的另一缺點(diǎn)是其中含有大量針對(duì)無(wú)關(guān)抗原的抗體。

兩種類型的多克隆抗體可以用于免疫親和層析柱，即針對(duì)合成肽或某種抗原中特定區(qū)域的抗體。在這兩種情況下，由于結(jié)合到層析柱上的抗原位點(diǎn)局限在一個(gè)很小的區(qū)域，因此可能實(shí)現(xiàn)有效的洗脫。

如果要將多抗用于免疫親和層析，一種方法是利用抗原親和層析柱來(lái)純化特異性的抗體。這種方法要求能得到足夠量的抗原供制備親和層析柱。另一種方法是利用針對(duì)某一物種蛋白的抗體，來(lái)純化其他物種的同源蛋白。用抗原親和層析柱來(lái)純化多克隆抗體時(shí)，只需收集與抗原結(jié)合的抗體，因?yàn)槭菑目乖舷疵撓聛?lái)的，從免疫親和層析柱上洗脫抗原的條件已經(jīng)確定，故不存在問(wèn)題。

2. 應(yīng)用單克隆抗體進(jìn)行免疫親和層析

應(yīng)用單克隆抗體進(jìn)行免疫親和層析具有許多優(yōu)點(diǎn)。單克隆抗體的來(lái)源不受限制，而且高親和力的單克隆抗體可以結(jié)合抗原的容量大，因?yàn)樗械目贵w都是均質(zhì)的，并結(jié)合相同的表位，所有結(jié)合的抗原可以在相同的條件下被洗脫。由于單克隆抗體結(jié)合的是抗原分子上的單一表位，抗原-抗體之間的結(jié)合鍵基本上是均質(zhì)的，洗脫抗原的條件也比使用多克隆抗體容易掌握。

應(yīng)用單克隆抗體進(jìn)行免疫親和層析時(shí)出現(xiàn)的問(wèn)題，通常涉及抗原的特性，低親和力或交叉反應(yīng)，低親和力通常是免疫親和層析法存在的共同問(wèn)題。使用單克隆抗體時(shí)，交叉反應(yīng)并不常見(jiàn)，主要出現(xiàn)在某些抗體的亞類上，由于抗體與其他抗原上的相同表位結(jié)合所致。這些表位可能有廣泛的同源性，這種性質(zhì)單克隆抗體可用于這些相關(guān)蛋白的研究，而不能用于抗原的純化。另一方面，交叉反應(yīng)可能只限于表位本身。在這種情況下，使用針對(duì)該抗原中其他表位的單抗能夠消除交叉反應(yīng)。另一個(gè)解決辦法就是采用其他層析或抽提技術(shù)從雜蛋白中純化抗原。

3. 用混合的單克隆抗體進(jìn)行免疫親和層析

除特殊情況外，一般不應(yīng)將混合單抗用于制備免疫親和層析柱。使用單克抗體混合物所遇到的與洗脫有關(guān)的各種問(wèn)題已在上面提到?；旌蠁慰雇ǔH用于純化那些在使用之前需要經(jīng)過(guò)變性的抗原，或制備抗原-抗體-微珠復(fù)合物用于免疫動(dòng)物。