WB是一種把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持物(NC膜或PVDF膜)，并以針對(duì)特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測(cè)。WB采用抗體作為探針，抗體可以與附著在固相支持物的靶蛋白的抗原表位發(fā)生抗原-抗體免疫反應(yīng)。這種技術(shù)的作用是對(duì)細(xì)胞或組織提取的蛋白混合物(即總蛋白混合物)中的某一特異蛋白進(jìn)行鑒別和半定量分析，旨在鑒別特異性蛋白的類型(如亞型、聚體、剪切體等)和蛋白表達(dá)量的變化。

WB可大致分為以下7步，分別是蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE電泳、電轉(zhuǎn)印、封閉、抗原-抗體免疫反應(yīng)、蛋白檢測(cè)。

一、蛋白提取

常規(guī)的樣品無(wú)外乎3種，分別是培養(yǎng)的細(xì)胞、動(dòng)物組織(磨碎或剪碎至肉眼觀察無(wú)顆粒)、術(shù)中切割的腫瘤細(xì)胞。這些樣品需要在裂解液或強(qiáng)去污劑中充分裂解，細(xì)胞中的物質(zhì)(總蛋白、基因、其它內(nèi)容物等)才能釋放出來(lái)，隨后離心取上清液(即總蛋白混合物)。常用的裂解成分大多包含Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸鈉等，這些成分具有較強(qiáng)的表面活性作用和還原作用，可將細(xì)胞膜或核膜裂解，釋放其中的物質(zhì)。同時(shí)，裂解液中還包含其它成分，如Tris-Hcl作為緩沖劑，可防止蛋白在提取過(guò)程中變性；以及Nacl，可防止提取的蛋白由于非特異性的聚集而形成聚體等。不同公司生產(chǎn)的裂解液成分大同小異，多是以上成分按不同比例組成，可分為弱、中、強(qiáng)三種不同裂解能力的裂解液。

最重要的是我們要清楚自己研究的蛋白到底在細(xì)胞哪里表達(dá)，是細(xì)胞膜、胞漿還是細(xì)胞核。這決定我們?cè)撌褂媚姆N強(qiáng)度的裂解液。如果裂解不充分，我們抽提的總蛋白中可能已經(jīng)不包括目標(biāo)蛋白或目標(biāo)蛋白隨著沉淀物被丟棄，那么整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)從一開(kāi)始就悄無(wú)聲息地失敗了。

二、蛋白定量

為什么要蛋白定量？首先要知道WB的目的是什么。WB是要比較同樣細(xì)胞數(shù)量的細(xì)胞或同等重量的動(dòng)物組織中目的蛋白的表達(dá)量高低變化。那么首先，我們需要控制樣品本身重量大小或細(xì)胞數(shù)量的多少對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，故不同組間的樣本需要控制一致才可提取蛋白。因此，在第1步中提取的蛋白上清液即是同等質(zhì)量下，同樣提取方法下，抽提的總蛋白混合物，這里面包含了各種各樣的蛋白。我們必須知道這個(gè)上清液中的總蛋白濃度，才能在第三步電泳時(shí)保-證每一個(gè)上樣孔中加入的總蛋白質(zhì)量一致，這樣后面對(duì)條帶上的蛋白定量分析才是有意義的。

我們?cè)鯓硬拍苤肋@個(gè)上清液中，總蛋白的濃度呢？目前有4種方法，分別是雙縮脲法、Lowry法、Bardford法和BCA法。較常用的是BCA法，其原理：蛋白質(zhì)可在堿性環(huán)境下將2價(jià)銅離子還原為1價(jià)銅離子，而1價(jià)銅離子可以與BCA試劑發(fā)生顏色反應(yīng)，2分子的BCA螯合后可形成紫色的復(fù)合物，這種復(fù)合物具有非常好的吸光性(用OD值反應(yīng))。在562nm的紫外光下，溶液中復(fù)合物的OD值與蛋白濃度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。我們可以通過(guò)這種線性關(guān)系大致地計(jì)算出自己的樣品中總蛋白濃度。

自然而然，我們需要一個(gè)OD值-蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。購(gòu)買商用的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(即包含已知濃度的蛋白溶液)，一般有25μg/μl、5μg/μl、4μg/μl三種。首先，按照(銅離子體積：BCA regent體積=1：50)配制BCA工作液。準(zhǔn)備好4mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，使用去離子水倍比稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，最-后配成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0等共8個(gè)不同濃度的蛋白溶液，單位μg/μl。隨后將自己的要測(cè)的樣品按照一定倍數(shù)稀釋(因?yàn)榇郎y(cè)樣品的蛋白濃度肯定是過(guò)高而超過(guò)BCA檢測(cè)的線性范圍，稀釋倍數(shù)根據(jù)樣本類型和經(jīng)驗(yàn)來(lái)定)。采用96孔板，每孔中加入200μl的BCA工作液和20μl待測(cè)樣品(一個(gè)孔一個(gè)樣品，如待測(cè)樣品數(shù)量為15，則一共使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白梯度濃度的8個(gè)孔+15=23個(gè)孔，小編建議每個(gè)孔做2個(gè)復(fù)孔，防止加樣誤差)。隨后放入37℃孵育箱，孵育30min，促使發(fā)生紫色螯合反應(yīng)。孵育結(jié)束后立刻拿到酶標(biāo)儀中，在562nm光下，測(cè)算每一個(gè)孔的OD值，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蛋白梯度濃度和其相應(yīng)的OD值用EXCEL表得出OD值-蛋白濃度線性公式(R方值建議0.99以或以上)；同時(shí)根據(jù)待測(cè)樣品的OD值和上述公式計(jì)算出每一份樣品中總蛋白的濃度。

測(cè)定完濃度的蛋白根據(jù)體積比例加入5X或者1X的蛋白上樣緩沖液，96℃以上水浴10min，使蛋白充分變性，解除二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，只保留一級(jí)鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)。上樣緩沖液一般成分及作用：SDS，可使得蛋白裹上足量的負(fù)電荷，所帶的負(fù)電荷大大超過(guò)了蛋白原有的電荷，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異；DTT還原劑，可打開(kāi)巰基維持單鏈的線性結(jié)構(gòu)；甘油，可起沉降作用使得混合的樣本沉降到加樣孔底部，不會(huì)逸散至加樣孔以外；溴酚藍(lán)為小分子藍(lán)色物質(zhì)，有指示作用。

三、SDS-PAGE電泳

終于到了電泳時(shí)刻。電泳是為了使得我們的加樣孔中同等質(zhì)量的總蛋白在相同電場(chǎng)作用下，從配置好的凝膠中由上往下遷移。我們都學(xué)過(guò)物理，知道帶電物體在電場(chǎng)中移動(dòng)距離與物體本身的電荷、物體的質(zhì)量相關(guān)。蛋白質(zhì)本身的電荷、質(zhì)量、結(jié)構(gòu)是不同的，這些都是影響蛋白在凝膠中移動(dòng)的因素。通過(guò)煮沸，我們讓蛋白僅保留了一級(jí)結(jié)構(gòu)；上一步添加的上樣緩沖液中SDS消除蛋白質(zhì)本身電荷的差異。那么此時(shí)，上樣的總蛋白中各種各樣蛋白在凝膠中的遷移距離只與蛋白的質(zhì)量相關(guān)。電泳時(shí)，整個(gè)凝膠處在一個(gè)大致呈“U”型的電場(chǎng)中，因此常能看到電場(chǎng)強(qiáng)度過(guò)高時(shí)，整條溴酚藍(lán)呈現(xiàn)微笑的形狀。

借助電泳時(shí)的電場(chǎng)力作用，首先總蛋白在較小電壓下移動(dòng)到濃縮膠和分離膠的交界處，此時(shí)見(jiàn)溴酚藍(lán)呈現(xiàn)一條筆直的藍(lán)線；隨后，在高電壓的作用下，所有孔道中的蛋白會(huì)同時(shí)開(kāi)始向下遷移，一定時(shí)間后，總蛋白中各種蛋白會(huì)在分離膠中的不同位置中分離開(kāi)，分離后蛋白所處的水平位置只與蛋白分子量大小有關(guān)。分子量大的蛋白靠上，而分子量小的蛋白靠下，溴酚藍(lán)則在最下面的位置。每一種分子量的蛋白會(huì)在分離膠中形成一條直線，當(dāng)然我們是看不見(jiàn)這條線的，這也是為什么我們要加溴酚藍(lán)的目的，溴酚藍(lán)剛好跑出最下方玻璃板時(shí)，電泳就可以停止了，否則你關(guān)注的小分子量蛋白可能會(huì)跑出膠外。我們可以通過(guò)彩色的Marker來(lái)大致地確定目標(biāo)蛋白在哪里。電轉(zhuǎn)印的時(shí)間和電轉(zhuǎn)強(qiáng)度需根據(jù)蛋白分子量來(lái)決定。

四、電轉(zhuǎn)印

電轉(zhuǎn)印就是將凝膠中的蛋白，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，即常用的NC膜和PVDF膜。這兩種膜表面都有肉眼不可見(jiàn)的小孔，都可以用來(lái)電轉(zhuǎn)印。NC膜全稱硝酸纖維素膜，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)可以與膜發(fā)生疏水作用而結(jié)合到一起，價(jià)格便宜，韌性差易碎，但易于封閉非特異性結(jié)合；PVDF膜全稱聚偏二氟乙烯膜，使用前需用無(wú)水甲醇活化(膜表面的正電基團(tuán)可被無(wú)水甲醇活化)，易于吸附蛋白質(zhì)，價(jià)格貴，韌性強(qiáng)，適合小分子量蛋白電轉(zhuǎn)印。

電轉(zhuǎn)時(shí)，電場(chǎng)線是垂直于我們的凝膠和膜的。因此凝膠中的蛋白質(zhì)再次在電場(chǎng)作用下向緊貼著凝膠的膜上轉(zhuǎn)移，并最終被吸附在膜的表面。我們可以通過(guò)麗春紅染色大致地評(píng)價(jià)電轉(zhuǎn)印的情況(麗春紅可將膜上的蛋白染成紅色，而膜其它位置基本不著色)，但是麗春紅染色僅僅是粗糙的評(píng)價(jià)方法，并不是我們的目標(biāo)蛋白是否轉(zhuǎn)移到膜上的直接證據(jù)，做＞150KD分子量蛋白的同志們尤其得注意。電轉(zhuǎn)印的時(shí)間和電轉(zhuǎn)強(qiáng)度需根據(jù)蛋白分子量來(lái)決定。

五、封閉

一旦電轉(zhuǎn)印結(jié)束，我們就開(kāi)始了封閉的過(guò)程，常采用5%、8%的脫脂奶粉或胎牛血清，室溫下，搖床孵育膜1h。常規(guī)采用奶粉即可，但是做磷酸化蛋白或某些特殊蛋白時(shí)必須使用胎牛血清封閉，因?yàn)槟谭壑泻写罅坷襛n酸，可使磷酸化蛋白的條帶變淺，甚至消失，同時(shí)也可能出現(xiàn)較高背景。

為什么要封閉呢？我們知道，電轉(zhuǎn)后蛋白質(zhì)已遷移至膜的表面，而膜上還存在大量的、未吸附蛋白質(zhì)的小孔。此時(shí)我們采用牛奶或胎牛血清封閉，其中包含大量的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)會(huì)吸附在那些小孔上，堵住這些孔。如果沒(méi)有封閉，那么在下一步我們添加的一抗將同時(shí)吸附在目標(biāo)蛋白和膜表面其它位置，且很難洗掉，最終ECL發(fā)光檢測(cè)時(shí)可出現(xiàn)非特異性條帶、雜帶、高背景等等，浪費(fèi)抗體不說(shuō)，還會(huì)影響最終的判斷。當(dāng)然，這些奶粉中的蛋白也會(huì)一定程度地吸附到目標(biāo)蛋白表面，但是與抗原-抗體特異性反應(yīng)相比，這種非特異性的結(jié)合會(huì)很輕松的在后面漂洗步驟中消除。

有時(shí)候也會(huì)遇到未封閉，但沒(méi)有出現(xiàn)雜帶。對(duì)此，小編只想說(shuō)，常在河邊走，哪有不濕鞋啊。

六、抗原-抗體免疫反應(yīng)

這一步是比較簡(jiǎn)單的。就是你購(gòu)買的特異性抗體與你的目標(biāo)蛋白發(fā)生抗原-抗體特異性免疫反應(yīng)。首先是一抗與目的蛋白表面的抗原表位結(jié)合，而膜表面其它位置的孔因?yàn)楸环忾]過(guò)程中牛奶的蛋白質(zhì)所填滿，因此結(jié)合量很少，后面漂洗時(shí)可去除。比較重要的是一抗孵育溫度和時(shí)間，最chang用的條件是4℃搖床過(guò)夜孵育，溫度適宜，分子運(yùn)動(dòng)溫和。有人也用37℃孵育1-2h，可能會(huì)成功，但是溫度越高，分子間的運(yùn)動(dòng)越激烈，那么出現(xiàn)非特異性雜帶的可能性就越高；同時(shí)孵育時(shí)間較短，也可能會(huì)導(dǎo)致一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合不充分。當(dāng)然，如果你使用的是多克隆抗體，那情況就更難說(shuō)了，一抗結(jié)合之后，就是采用二抗，二抗可與一抗結(jié)合，而二抗蛋白結(jié)構(gòu)被HRP辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，可與發(fā)光底物相結(jié)合，該 底物*的信號(hào)輸出能夠使皮克量的蛋白得到檢測(cè)。

總之，選好自己的一抗是很重要的。特異性高的一抗，WB你怎么做都能出；特異性差的抗體，WB發(fā)明人都不一定做得出來(lái)。建議不要省錢買國(guó)產(chǎn)抗體，你懂得。買抗體之前，看看近年發(fā)的高分文章，查查他們用的什么哪個(gè)公司抗體。如果找不到參考，一定要買經(jīng)過(guò)該抗體公司敲除驗(yàn)證過(guò)的抗體。

七、蛋白檢測(cè)

前幾步，我們幾乎無(wú)法看到膜上有啥變化，條帶也看不見(jiàn)在哪，反正就是一直將膜洗洗涮涮。終于到了蛋白檢測(cè)，這也是WB最-后一步，終于可以一睹蛋白條帶的真容了。

蛋白檢測(cè)包括DAB法和ECL發(fā)光法。DAB法就是和免疫組化染色類似，出現(xiàn)的條帶在肉眼下即可見(jiàn)，呈現(xiàn)棕黃色，條帶可保存1-2年，但是現(xiàn)在用的較少。目前較多采用的是ECL化學(xué)發(fā)光法，ECL工作液包括魯米諾(是的，就是我們看刑偵節(jié)目時(shí)案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)看血跡的東西)和過(guò)氧化物，二者避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用(1：1配制)，用時(shí)滴在膜上就行，目標(biāo)條帶將在黑暗環(huán)境下發(fā)出熒光，熒光會(huì)進(jìn)一步在膠片上曝光，熒光越強(qiáng)則膠片上曝光的條帶越黑，最-后洗出膠片即可?，F(xiàn)在還有凝膠成像儀可以使用，省去了膠片曝光和洗膠片的步驟，方便而高-效，再也不用去小黑屋待著發(fā)光了。