最初接觸基因克隆和構(gòu)建載體時(shí)，總會(huì)遇到這樣那樣的問(wèn)題，構(gòu)建載體作為很多實(shí)驗(yàn)的必須步驟，不應(yīng)該成為阻擋后續(xù)實(shí)驗(yàn)的障礙。這是因?yàn)橥ǔ?lái)說(shuō)，載體構(gòu)建相關(guān)的問(wèn)題都過(guò)于簡(jiǎn)單，下面就來(lái)了解一下！

構(gòu)建載體常出現(xiàn)的問(wèn)題
1、無(wú)法成功克隆到基因
2、基因無(wú)法成功連接至載體
3、檢測(cè)質(zhì)粒時(shí)發(fā)現(xiàn)目的基因大小不對(duì)
4、檢測(cè)質(zhì)粒時(shí)發(fā)現(xiàn)大小差不多，但測(cè)序結(jié)果不對(duì)

一般，在構(gòu)建載體時(shí)，能遇到的也就這幾個(gè)問(wèn)題，如果有其他問(wèn)題存在也大概與上述四個(gè)問(wèn)題是密切相關(guān)的。需要說(shuō)的是，如果載體構(gòu)建出了狀況，就不要一味的重復(fù)了，一遍不成功，十遍也絕不會(huì)對(duì)。如果出現(xiàn)例外，那是小概率事件。

那出現(xiàn)上述問(wèn)題后從哪幾方面思考呢？
1、確?？寺〉降幕?正確：
如果這一步出問(wèn)題，無(wú)非兩點(diǎn)原因：引物設(shè)計(jì)不合理，模板質(zhì)量不高。
解決方法：多找?guī)讉€(gè)模板同時(shí)進(jìn)行克?。恢匦略u(píng)估引物的合理性和特異性，比如將引物長(zhǎng)度增至40 bp左右。

2、關(guān)于酶切
酶切其實(shí)要求并不十分嚴(yán)格，正常操作下，不論電泳檢測(cè)是否十分清楚，酶切產(chǎn)物足夠連接用量了，沒(méi)必要糾結(jié)。

3、關(guān)于酶切位點(diǎn)的選擇
這一點(diǎn)很重要。通常很多同學(xué)在選擇酶切位點(diǎn)時(shí)，會(huì)習(xí)慣性的選擇師兄師姐們常用的酶切位點(diǎn)，比如BamHI等，但實(shí)際上這樣是不行的。此時(shí)需要注意：目的基因中不能出現(xiàn)所選酶切位點(diǎn)，否則，在連接時(shí)，殘留的酶會(huì)對(duì)目的基因進(jìn)行切割，這將直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。
解決辦法：選擇酶切位點(diǎn)前，需要檢查所選酶切位點(diǎn)是否存在于目的基因中。

小結(jié)
總之，如果構(gòu)建載體時(shí)出現(xiàn)問(wèn)題，就從這幾方面一一排除：
引物設(shè)計(jì)是否合理？
酶切位點(diǎn)是否選擇正確？
模板質(zhì)量是否較好？
PCR程序是否設(shè)置正確？
如果以上幾點(diǎn)都沒(méi)問(wèn)題，那載體構(gòu)建就不會(huì)出問(wèn)題。
最后，其實(shí)不管構(gòu)建載體還是其他實(shí)驗(yàn)，有時(shí)做不出來(lái)，排除最本質(zhì)的原因之外，如果正常操作下出現(xiàn)狀況，一定是哪一步做錯(cuò)了或者疏忽了，應(yīng)該盡量避免一味的機(jī)械重復(fù)。