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Biozellen®3D細胞培養(yǎng)基質膠在3D細胞球體培養(yǎng)試驗
3D 細胞球體培養(yǎng)試驗步驟：
A、試劑制備
1、A 基質膠：將 A 基質膠溶于 37℃水浴槽回溫 10 分鐘， 確認*融解.
2、C 緩沖溶液(1X)制備：使用前將 10X C 緩沖溶液用冰的無細胞培養(yǎng)液(例如： 無血清 DMEM、opt-MEM)制備成 1X C 緩沖溶液。(不要用 PBS 稀釋 C 緩沖液) .
3、D 緩沖溶液(1X)制備: 使用前用冷的 1x PBS 稀釋 10X D 緩沖溶液至 1X D 緩沖溶液.
B、Biozellen®3D 細胞培養(yǎng)基質膠的制備
全部步驟需要在無菌環(huán)境內操作，操作步驟如下：
1、將 24 孔培養(yǎng)板放置于冰上預冷半小時。
2、細胞計數后取 2×105~2×107 細胞與 0.5 毫升 37℃ 細胞培養(yǎng)基均勻混合，并與 0.5 毫升 37℃ A 膠按照 1:1 等比例均勻混合，最終細胞密度 1*105~1*107cells/mL。
注：請選擇適當的培養(yǎng)溶液與條件進行試驗。
3、取 20-40 微升步驟 2 的混合液滴于 步驟 1 預冷的培養(yǎng)板上，膠體將于 5 分鐘內成膠。 注: 測試膠體是否成膠，可用微量吸管尖溫和的觸碰膠體表面進行確認。
4、待膠體成膠后，添加 1 毫升冰的 1X C 緩沖溶液，并蓋過步驟 3 的膠溶液，固定 15 分鐘。
5、待 15 分鐘固定后，小心的吸取 C 緩沖溶液并置換為適合此細胞生長之培養(yǎng)基溶液。
6、將含有細胞的膠于 37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱內進行 7~14 天的培養(yǎng)，并觀察細胞球體的形成，按正常培養(yǎng)基更換頻率進行更換操作。
C、溶膠與收集細胞球體準備程序
1、小心的將培養(yǎng)基吸取移除，并用 1X PBS 進行清洗。
2、小心的將 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的 D 緩沖溶液，蓋過膠滴于室溫反應 5 分鐘。
3、溫和的用 1 毫升移液管吸取，直到膠滴*溶解。
4、將含有細胞球體的溶液吸入 1.5 毫升離心管，用 1000 rpm 的轉速離心 10 分鐘，移除上清液體并收集細胞球體做分析。
D、收集單顆細胞準備程序
在分離單細胞前，先按上述溶膠與收集細胞球體準備程序進行操作
1、添加 trypsin-EDTA 并與收集的細胞球體于 37°C 混合反應。
2、用 1 毫升移液管混合，直到細胞體*分解。
3、待細胞球體*分解，加入 3 倍體積的 1X PBS，并用 1000 轉的轉速進行離心 10 分鐘，并移除上清液體收集沉淀的單細胞做分析。
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