什么是熒光定量PCR？

指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)
PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見(jiàn)”，最后通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA(or cDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法。

定量PCR原理？

與傳統(tǒng)PCR一樣,反應(yīng)在溫度模塊里循環(huán)進(jìn)行；理論上每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)目的基因的數(shù)量都會(huì)增加一倍；每個(gè)循環(huán)結(jié)束后,定量PCR儀器通過(guò)不同的濾光片記錄熒光信號(hào)；在擴(kuò)增過(guò)程中,熒光信號(hào)隨著PCR產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)。

定量PCR體系？

普通的PCR體系；模板,引物,dNTPs，buffer，Taq酶；加入各種類型的熒光染料。

在做Real time PCR時(shí)，對(duì)于SYBR Green I染料法和Taqman探針?lè)ǘ伎梢裕嵌哂袇^(qū)別。SYBR Green I染料法是利用SYBR Green I結(jié)合雙鏈DNA來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，可用于監(jiān)測(cè)任意雙鏈DNA序列的擴(kuò)增，但是必須考慮非特異性擴(kuò)增。因成本相對(duì)低，是目前較常用的)。但是由于SYBRGreen I可以與所有的雙鏈DNA結(jié)合，包括非特異性的雙鏈DNA序列，因此可能會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。

圖1：SYBR染料法原理圖

Taqman探針?lè)ㄊ褂脽晒馓结槞z測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的特異PCR產(chǎn)物：特異性熒光信號(hào)的產(chǎn)生，需要探針與目標(biāo)序列進(jìn)行特異性的雜交；探針可以標(biāo)記不同的報(bào)告基團(tuán)，因此可以在一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行二條序列擴(kuò)增完整的探針。5′端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3′端熒光淬滅基團(tuán)(發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移)；退火，探針與模板結(jié)合，引物在聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應(yīng)，遇到探針時(shí)發(fā)揮3′-5′外切酶活性將探針切碎到反應(yīng)體系中；報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)距離變大，在激發(fā)光的作用下發(fā)熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，價(jià)格高。

圖2：TaqMan探針?lè)ㄔ韴D

說(shuō)了這么多，不知道小伙伴們對(duì)qPCR的理解是不是清晰多了呢?qPCR作為一種簡(jiǎn)單便捷的定量技術(shù)，應(yīng)該是小伙伴們常用的技術(shù)了。雖然聽(tīng)起來(lái)簡(jiǎn)單但做起來(lái)卻沒(méi)有想象的那么簡(jiǎn)單，事實(shí)上，實(shí)驗(yàn)室做一個(gè)樣本檢測(cè)QPCR需要1~2個(gè)小時(shí)，這個(gè)時(shí)候不僅試劑盒重要，檢測(cè)能力也很重要，希望這篇文章能幫助小伙伴們對(duì)QPCR有一個(gè)清晰的了解