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實時熒光定量PCR技術(shù)

來源：深圳市安培生物科技有限公司 2022年03月11日 10:33

原理

實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

材料與儀器

細(xì)胞樣品
RNA提取試劑盒熒光定量PCR Mix TRIZOL dNTP 氯仿逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 異丙醇 Taq酶 DEPC水 ddH2O TE MgCl2 瓊脂糖溴化乙錠 MOPS 甲醛乙酸鈉 EDTA EB 溴酚蘭
離心管離心機(jī) 風(fēng)光光度計電泳槽凝膠板 Realtime PCR儀

步驟

一、樣品RNA的抽提

1. 取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。

2. 兩相分離每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

3. RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

4. RNA清洗移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?℃下7 000 rpm離心5分鐘。

5. RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

6. 溶解RNA沉淀溶解RNA時，先加入無RNA酶的水4 0ul用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

二、 RNA質(zhì)量檢測

1. 紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度和純度。

（1）濃度測定

A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 x 稀釋倍數(shù) x 40 ug/ml。具體計算如下：

RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀釋至495 ul的TE中，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul

取5 ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 ul，剩余RNA總量為：

35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

（2）純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

2. 變性瓊脂糖凝膠電泳測定

（1）制膠

1 g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10x MOPS電泳緩沖液

濃度成分

0.4 M MOPS，pH 7.0

0.1 M 乙酸鈉

0.01 M EDTA

灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

（2）準(zhǔn)備RNA樣品

取3 ugRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

（3）電泳

上樣前凝膠須預(yù)電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3 cm。

（4）紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。

三、樣品cDNA合成

1. 反應(yīng)體系

序號反應(yīng)物劑量

1 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2 ul

2 上游引物 0.2 ul

3 下游引物 0.2 ul

4 dNTP 0.1 ul

5 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5 ul

6 DEPC水 5 ul

7 RNA模版 2 ul

8 總體積 10 ul

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。

2. 混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 ul，37℃水浴60分鐘。

3. 取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

四、梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR

1. β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3 μl按10倍稀釋（加水27 ul并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。

2. 反應(yīng)體系如下：

標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系

序號反應(yīng)物劑量

1 SYBR Green 1 染料 10 ul

2 陽性模板上游引物F 0.5 ul

3 陽性模板下游引物R 0.5 ul

4 dNTP 0.5 ul

5 Taq酶 1 ul

6 陽性模板DNA 5 ul

7 ddH2O 32.5 ul

8 總體積 50 ul

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。

3. 管家基因反應(yīng)體系：

序號反應(yīng)物劑量

1 SYBR Green 1 染料 10 ul

2 內(nèi)參照上游引物F 0.5 ul

3 內(nèi)參照下游引物R 0.5 ul

4 dNTP 0.5 ul

5 Taq酶 1 ul

6 待測樣品cDNA 5 ul

7 ddH2O 32.5 ul

8 總體積 50 ul

輕彈管底將溶液混合， 6000 rpm短暫離心。

3. 制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。

五、制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板

1. 針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

2. 反應(yīng)體系

序號反應(yīng)物劑量

1 10× PCR緩沖液 2.5 ul

2 MgCl2 溶液 1.5 ul

3 上游引物F 0.5 ul

4 下游引物R 0.5 ul

5 dNTP混合液 3 ul

6 Taq聚合酶 1 ul

7 cDNA 1 ul

8 加水至總體積為 25 ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72?C延伸5分鐘。

（3）PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

（4）將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。

六、待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR

1. 所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應(yīng)體系。

2. 體系配置如下：

序號反應(yīng)物劑量

1 SYBR Green 1 染料 10 ul

2 上游引物 1 ul

3 下游引物 1 ul

4 dNTP 1 ul

5 Taq聚合酶 2 ul

6 待測樣品cDNA 5 ul

7 ddH2O 30 ul

8 總體積 50 ul

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。

（3）將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。

七、實時定量PCR使用引物列表

引物設(shè)計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)。

八、電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

注意事項

1.熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長長期設(shè)定一個熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)（即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量標(biāo)準(zhǔn)）。熒光閾值可設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但實際應(yīng)用要結(jié)合擴(kuò)增效率，線性回歸系數(shù)等參數(shù)來綜合考慮。

2.Ct值：在PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物（熒光信號）到達(dá)閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。Ct值具有很好的重復(fù)性。

常見問題

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性很好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最準(zhǔn)確定量方法，已得到大眾的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

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