定量蛋白質組學研究中的熒光差異凝膠電泳技術

要開展蛋白質組學研究，雙向電泳是你必須了解掌握的zui基礎的蛋白質分離技術，正如普通凝膠電泳對于核酸純化?？墒且惶崞痣p向電泳，多數(shù)人還是會直皺眉頭----別搖頭擺手又嘆氣啦，今天的雙向電泳早已深入改進了，特別是其中zui熱門的熒光差異凝膠電泳技術（DIGE），因為消除了傳統(tǒng)雙向電泳的一些弊端，已經使得好多實驗室對雙向電泳重拾信心，并逐漸得到越來越多的科學家的認同。要知道基于雙向電泳的蛋白質組分析文獻每年都穩(wěn)步增長，采用DIGE技術進行研究的科研論文的比重從2004年的不到2%猛增到2008年的19.6%呢。來吧，放下偏見，不要錯過，跟著重新認識這功能強大的DIGE吧。

前塵往事

一直備受爭議的雙向電泳何以這么不招人待見呢?長話短說。

生物樣品中蛋白質的復雜多樣性遠超核酸，使得單向電泳無法滿足蛋白樣品分離分析的需求。1975年O`Farrell介紹了雙向電泳技術，采用等電聚焦和SDS-PAGE在等電點和分子量兩個方向上對蛋白質進行分離，使得原本密密麻麻都擠在一條泳道上的蛋白質得以在另外一個方向上有效分開。這個在當時創(chuàng)意的設計雖然被寫進了教科書中成為經典技術，可惜在隨后的實際應用中卻遇到種種問題。由于當時*向電泳的基質是采用兩性電解質配置pH梯度膠，兩性電解質的不穩(wěn)定性導致等電點聚焦結果嚴重受到實驗室條件和操作手法等偶然因素的影響，第二向電泳結果就更不用說了----即使不是差之毫厘繆之千里，這種不確定性也導致了雙向電泳結果可重復性差，穩(wěn)定性差。不單各實驗室之間的結果難以比較，即使同一實驗室的結果也不怎么確定。我們都知道，實驗的可重復性是實驗可信度的重要指標，也是同行評議的重要基礎。這種不穩(wěn)定導致的爭議可想而知。用不確定的方法研究不確定的未知，會“負負得正”嗎?不可能。再加上操作和結果分析的極其復雜，難怪一提起雙向電泳，人人皺眉。

直到上世紀九十年代，安瑪西亞公司（通用電氣生命科學的前身）推出了商品化的固相pH梯度膠條，極大的提高了等電聚焦的可重復性，這才使得上不同實驗室間雙向電泳實驗結果比較成為可能。

可是雙向電泳技術，依然是不可替代的，具有其他任何分離技術*的高分辨率，可以看到相應蛋白質的等電點和分子量信息，對于蛋白質的翻譯后修飾和Isoform也可以清晰展示。因此，盡管當時爭議不斷，一些科學家和生物技術公司依然青睞2D技術，依然不懈地針對雙向電泳的缺點而努力進行技術改良。

不比不知道

比較，是一種習慣，一種本能，也是一種學問。從學生時代“期末考試第幾名?”，到如今人人熱衷的各種的xxx排行榜，以及五花八門的比賽，從不間斷地彰顯人們對比較的熱愛。在生命科學研究領域，比較更是一種探索求知的zui重要的手段----腫瘤組織和正常組織有什么不同?從同一細胞中分化而來的不同組織有何差異?不比不知道，經過各種比較手段找出差異，再研究這些差異的前因后果，一直是生命科學領域zui常用的研究思路。核酸表達差異的研究方法包括差異顯示，芯片技術，DD-PCR等等，但核酸表達差異的研究zui終無法替代蛋白質差異研究。比較不同樣品間蛋白質的種類和量的差異，依然是另一個重要的研究方向。由于雙向電泳具有其他任何分離技術*的高分辨率，可以看到相應蛋白質的等電點和分子量信息，對于蛋白質的翻譯后修飾和Isoform也可以清晰展示。因而成為蛋白質表達差異研究的重要手段。

然而，雙向電泳的膠間差異仍然很大，即使應用現(xiàn)在很的雙向電泳分析軟件，仍然有很多蛋白質斑點無法正確匹配。即使那些匹配的蛋白點之間也無法確定其準確的定量關系。較大的系統(tǒng)誤差導致該技術無法有效地區(qū)分系統(tǒng)誤差和樣品間的差異，因此需要需要花費大量的時間和勞動運行重復膠以期得到更準確的定量結果。

繽紛熒光照亮雙向電泳

多色熒光標記是偉大的技術發(fā)明，正是繽紛的熒光世界使得實驗不再受困于孤獨的單色標記，同時進行“多重Multiplex”檢測成為可能。無論是高通量測序、定量PCR，芯片，流式，細胞成像，染色體原位雜交等等領域，多色熒光標記都有著極為重要的應用（詳細請看新技術專欄）。

1997年，Unlu等發(fā)表了*篇熒光差異凝膠電泳的論文，將不同的樣品分別用不同的熒光染料進行標記后混合在同一塊凝膠中進行雙向電泳，極大地提高了實驗結果的重復性和定量的準確性。2001年，Tonge等以小鼠肝臟作為實驗材料，評價了該實驗方法，并給予了很高評價。安瑪西亞公司（現(xiàn)在的通用電氣公司）從Carnegie Mellon大學購買了這種多通路熒光技術和雙向電泳技術結合的后，全面系統(tǒng)地發(fā)展改進了熒光差異凝膠電泳技術，一如前面提及，如今的Ettan DIGE使得許多實驗室對雙向電泳重拾信心，并受到越來越多科學家認同。相比傳統(tǒng)的雙向電泳，Ettan DIGE技術究竟有哪些*的創(chuàng)新和改進使之更勝*呢?

三色熒光標記

傳統(tǒng)的雙向電泳膠間差異大，甚至難于區(qū)分系統(tǒng)誤差還是樣品間的表達差異，難以進行蛋白質差異研究。Ettan DIGE熒光差異凝膠電泳技術在傳統(tǒng)雙向電泳技術的基礎上結合了多重熒光分析的方法，可在同一塊膠上同時分離多個分別由不同熒光標記的樣品。由于不同的熒光標記樣品有不同的激發(fā)波長，可通過不同的濾光片記錄互不干擾的膠圖結果。由于有了多色熒光標記，使得在同一塊膠中分離并分析多個樣本成為可能。這樣有效避免了不同膠間的系統(tǒng)誤差，特別適合比較不同樣本間差異。Ettan DIGE還在雙色熒光的基礎上增加了第三色熒光標記，作為內標（后面介紹）。

熒光染料種類雖多，但用于蛋白質組樣品標記的熒光染料不同于普通熒光染料，標記后的蛋白質不應該有等電點上的改變，分子量上的改變也應該保持zui小而且不同熒光染料導致的分子量的改變應該一致。用于蛋白質預先標記的熒光染料分為兩類，zui小標記和飽和標記。其中zui小標記熒光染料包括三種，分別是Cy2，Cy3和Cy5。這三種熒光染料化學結構上相似，分子量接近，帶有相同的活化基團-NHS脂，可以特異性的標記在賴氨酸殘基的ε氨基上，由于三種染料均帶有一個正電荷，這樣通過取代反應蛋白質的等電點不會發(fā)生改變，保證了不同樣品中的相同蛋白質可以泳動到相同的位置。不過要注意，過多的染料標記會導致蛋白質的疏水性增加而不易溶解。保持1～2 %的蛋白質的賴氨酸殘基被熒光標記修飾，才可以維持被標記的蛋白在電泳時的溶解性，因此，在標記樣品時，保證合適的蛋白質和染料的摩爾數(shù)比例至關重要。通過調整合適的pH值、合適的染料和蛋白質的摩爾比，可以保證每個蛋白質分子zui多只標記上一個染料分子，來保證蛋白質的分子量變化zui小。

另外，采用DIGE進行蛋白質分離后，如果需要切取蛋白質斑點進行進一步分析，則需要注意，雖然經熒光標記后在電荷上未發(fā)生變化，但是由于熒光團的加入（500Da左右）使得在標記的和未標記蛋白之間產生分子量上的差異，被熒光標記的蛋白質比未標記的蛋白質點在第二向SDS-PAGE時會有些許遷移偏差，對于那些小分子蛋白質來說，其熒光顯色的中心并非蛋白濃度zui高的地方，因此切取點這些蛋白質斑點時需要考慮這個偏差。一般而言，在采用DIGE膠分析并得到相關差異蛋白質結果后，需要運行制備膠用來進行斑點切取。

飽和標記的熒光染料包括兩種，標記蛋白質上的半胱氨酸殘基，主要用于一些來源和珍貴的微量樣品的研究中。飽和標記可避免上述問題，但是使用成本較高。在采用飽和標記分析蛋白質組樣品時，必須*行染料量的滴定，以確定合適的還原劑和染料的加量，否則，在DIGE膠圖上很輕易造成水平鏈狀的點或垂直拖尾。另外，由于被標記了的蛋白質的分子量發(fā)生了改變，飽和標記的膠圖和銀染的膠圖有所不同。

神奇的內標

可能是出于節(jié)約的考慮，一些實驗“老手”常常忽略實驗參照。其實是很不好的實驗習慣。實驗設計中的參照對于實驗來說非常重要。內標是參照體系中的一個重要概念。Alban等詳細的闡述了內標的概念和意義。

Ettan DIGE技術*次在雙向電泳中引入了內標。DIGE的內標是將試驗中所有樣品取等量混合，單獨用一種熒光染料（在zui小標記染料中通常是Cy2）標記，和所有樣品一起電泳。這意味著所有樣品中的蛋白質點都會有對應的內標。通過內標可以方便的對膠內不同熒光染料標記的樣品和膠間樣品進行歸一化定量，而且不同凝膠之間的匹配變得異常輕松。

傳統(tǒng)雙向電泳技術可分別在等電點和分子量兩個方向上對蛋白質組進行分離，然而在第三個方向即定量準確性上并不盡如人意。內標在雙向電泳中的引入，極大地提高了結果的定量準確性，可靠性和重復性，有效降低了系統(tǒng)誤差，給雙向電泳增加了第三個方向，確保了實驗結果的高可信度。

實驗流程

DIGE的基本實驗線路是電泳前以Cy2、Cy3 和Cy5三種熒光染料分別標記蛋白質樣品（其中包括一個蛋白質內標）。然后將標記好的蛋白質樣品混合，在同一塊膠上進行雙向電泳。電泳結果分別用3種不同的激發(fā)波長得到不同顏色的熒光信號，根據(jù)這些信號的比例來判定樣品之間蛋白質的差異。由于每個蛋白點都有它自己的內標，可避免在匹配時出現(xiàn)的誤差。進行定量分析時也不再需要依靠于膠與膠之間的重復性，可用以比較數(shù)據(jù)庫中各個膠之間的蛋白質的量的差異。軟件可全自動根據(jù)每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE技術可檢測到樣品間小于10%的蛋白表達差異，統(tǒng)計學可信度達到95%以上。

Friedman等通過采用內標的DIGE實驗設計對人直腸癌樣品進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)52個差異蛋白質中，有42個是在有內標的實驗設計中才可能被發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白質都是用來診斷直腸癌的潛在的生物標記物，也可能成為治療的藥物靶標。由于熒光標記靈敏度很高，DIGE的靈敏度可與銀染和SYPRO Ruby 相媲美，可檢測到100～200pg 的蛋白質，而其線形動態(tài)范圍在5個數(shù)量級左右。即使少至5μg的微量樣本也可以用Ettan DIGE進行蛋白質組學分析。

同樣準確的結果，只要跑更少的膠

跑雙向膠始終是體力和耐力活兒，需要花費大量時間和精力的。相比傳統(tǒng)2D，DIGE可以讓你跑更少的凝膠而獲得同樣高質量的準確結果。

這首先歸功于多色熒光標記。因為多色熒光標記可以在同一次檢測中分析同一膠上的不同標記樣品的熒光信息，因而可同時在一塊膠上、在相同電泳條件下同時分離2個樣品，提高了電泳膠的“利用率”，減少了實驗需要的膠的總數(shù)，也節(jié)省了操作時間和成本。由于并行電泳減少膠間差異，使得分析結果的過程也大大簡化;還可避免由于實驗方法造成的蛋白質斑點強度的差異，比如樣品在進入膠條時會有不同程度的樣品損失等。

其次，在進行傳統(tǒng)雙向電泳實驗時，通常需要運行生物學重復和技術重復（即重復膠）以排除樣品的個體差異和實驗的系統(tǒng)誤差。由于DIGE技術將系統(tǒng)誤差降至zui低，又增加了內標對不同凝膠之間進行定量的歸一化，因此采用DIGE技術，無需運行重復膠。

以一個簡單的例子，如果現(xiàn)在要研究某種藥物對小鼠肝臟蛋白質組的影響，需要2組各4只小鼠（生物學重復），分別注射藥物及安慰劑，然后在某一時間點取肝臟抽提蛋白質組樣品進行分析。傳統(tǒng)2D電泳需跑4塊重復膠（技術重復），總共需要跑32塊2D凝膠。采用DIGE技術無需運行重復膠，8只小鼠的肝臟蛋白質可以分別運行在4塊凝膠上即可以得到高質量的實驗結果。凝膠數(shù)量減少至8分之1，不單所費時間和成本大大減少，膠間差異得到了有效控制，找到真實的生物學差異的可能性也大大的提高了!實驗結果的準確性大幅提高，在確定的差異蛋白斑點中，假陽性結果降至zui低，相關的質譜鑒定成本也大幅降低!zui關鍵的是，得出錯誤結論的可能性也降至zui低!（把藥物組設為A，安慰劑組設為B，小鼠的編號為1-4的話，考慮樣品的隨機化原則，正確的實驗設計應該是如下：你算得出為什么嗎?）

整體化解決方案

誰都知道配套的產品用，不用考慮產品之間的兼容問題。對于種類繁多，樣品制備復雜的蛋白質組研究，完善配套的工具可以使工作事半功倍。全力開發(fā)并推廣DIGE的GE公司深諳此道。在雙向電泳設備的基礎上，GE提供全部的DIGE系統(tǒng)組件：專門用于DIGE的熒光染料，用于DIGE凝膠成像的掃描系統(tǒng)，的Typhoon系列激光共聚焦掃描成像系統(tǒng)，用于DIGE圖像自動分析的DeCyder軟件。由于GE公司已經購買相應熒光染料的，你不用擔心的問題。

用于DIGE膠成像的設備包括專門用于Ettan DIGE成像的EDI成像儀和多功能激光共聚焦掃描成像儀Typhoon。熒光染料在激發(fā)和發(fā)射圖譜中有小部分重疊，可能會出現(xiàn)信號的相互干擾，因而選擇合適的掃描儀器及正確的參數(shù)設定至關重要。EDI成像儀專門用于DIGE膠成像，操作簡單，無需過多的參數(shù)設置。如果你正好有Typhoon系列掃描儀，那就不需配置EDI了，Typhoon掃描成像系統(tǒng)專門為DIGE膠掃描進行了優(yōu)化，掃描得到的膠圖可以被相應的分析軟件直接讀取，其靈敏度可以達到銀染靈敏度的十倍，而*的動態(tài)范圍和定量的準確性也為DIGE系統(tǒng)能夠定量提供了硬件支持和保證。

DeCyder軟件是整個DIGE平臺的重要組成部分，共找點的設計，的膠間匹配，采用多種統(tǒng)計學分析方法令結果分析變得簡單快速。雖然目前市場上有多種雙向電泳分析軟件宣傳可以分析DIGE凝膠，然而DeCyder軟件始終是那些期望定量和準確分析的科學家的。DeCyder軟件目前已經更新到6.5版，相比之下，其他的分析軟件都是在DeCyder分析軟件推出后，在學習和消化后更新自己的版本。正版價格貴，那也是*的。不過對于精密嚴謹?shù)膶嶒?，還是提倡正版的。

作為一個新的技術平臺，Ettan DIGE技術正逐漸被廣大科學家認可，2007年Frost&Sullivan將2007年技術創(chuàng)新獎授予了通用電氣醫(yī)療集團，以表彰其將熒光差異凝膠電泳技術引進美國蛋白電泳市場。2008年，包括DIGE平臺在內的通用電氣的蛋白質和蛋白質組分離分析技術榮獲了生命科學工業(yè)成就獎。DIGE技術也不斷被應用到很多研究領域，到2008年5月份，DIGE技術的應用文獻已經多達1100余篇，平均影響因子為5.5。包括用于鑒定新藥蛋白靶點，開發(fā)新的治療策略;可靠監(jiān)測疾病的發(fā)生過程和治療過程;鑒定生物標記物用于早期診斷;藥物分子機理或毒性研究;理解發(fā)育過程;植物蛋白質組學，環(huán)境蛋白質組學等都有很多文獻。已經成功分析的樣品包括細胞培養(yǎng)物，植物， 真菌， 細菌，海洋生物，動物模型樣品，體液，如血液、腦脊液和唾液等，人的組織樣品,，病理切片，激光捕獲顯微切割（LCM）的組織和細胞等。

怎么樣?現(xiàn)在對DIGE感覺不一樣了吧!`