復(fù)旦大學(xué)于敏教授課題組《AJPS》：高精度3D打印用于抗凝藥物重組水蛭素 (r-hirudin) 新型微創(chuàng)無(wú)痛遞藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)制備

抗凝治療通常被用作心腦血管疾病治療的首.選策略，且此類患者大多需要長(zhǎng)期甚至終身服用抗凝藥物。直接口服抗凝劑有導(dǎo)致胃腸道出血的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是對(duì)于有胃腸道疾病如胃腸道潰瘍的患者，這種出血是致命的。皮下或靜脈注射給藥或可規(guī)避胃腸道出血的風(fēng)險(xiǎn)，但是注射給藥需專業(yè)人員輔助，這對(duì)長(zhǎng)期用藥的患者而言極其不便，注射引起的疼痛亦會(huì)導(dǎo)致患者用藥依從性較差。此外，皮下注射抗凝劑還會(huì)導(dǎo)致皮下出血淤青，增加感染風(fēng)險(xiǎn)，給抗凝藥物臨床應(yīng)用帶來(lái)了很的不便。透皮給藥作為一種前瞻性給藥策略，可以補(bǔ)充注射和口服給藥的局限性 (圖1)。
 

圖1. 臨床抗凝藥物給藥方式及不良反應(yīng)

微針 (Microneedle，MN) 作為微米級(jí)的微創(chuàng)設(shè)備，可通過(guò)破壞皮膚最外層角質(zhì)層產(chǎn)生短暫的疏水性毛孔，將治療藥物輸送至表皮中，被認(rèn)為是最有前途的透皮給藥系統(tǒng)之一。目前，微針的制備主要通過(guò)微模型澆鑄法，但是用于微模型制備的方法大多局限于光刻或者化學(xué)蝕刻，工藝復(fù)雜、周期長(zhǎng)且成本高，限制了微針的多樣性和個(gè)性化發(fā)展。高精度 3D 打印是近年來(lái)新興的一種微模型制備方法，由于該法簡(jiǎn)單高效且成本相對(duì)較低，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥的各領(lǐng)域，為微針陣列模型的設(shè)計(jì)制備提供了新的選擇。

圖2.微針陣列模型的設(shè)計(jì)與打印 A. 1#微針陣列模型的計(jì)算機(jī)模擬(左)、打印預(yù)覽(中)及3D 打印微針的長(zhǎng)度(右)；B.2#微針陣列模型的計(jì)算機(jī)模擬(左)、打印預(yù)覽(中)及3D 打印微針的長(zhǎng)度(右)；C.設(shè)計(jì)模型和打印模型對(duì)比

近期，復(fù)旦大學(xué)代謝分子醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于敏教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院沈騰老師提出了一種基于 3D 打印技術(shù)的微模型制備方法。該團(tuán)隊(duì)利用新型超高精度 3D 打印技術(shù) (nano Arch P140，摩方精密) 實(shí)現(xiàn)了個(gè)性化設(shè)計(jì)的微針陣列模型的制備，并通過(guò)開(kāi)發(fā)一條新的模型復(fù)刻工藝成功制備了基于 3D 打印模型的微針模具，最終制備了 r-hirudin 新型微創(chuàng)無(wú)痛遞藥系統(tǒng)。該方法成功解決了以光敏樹(shù)脂為打印材料的微針陣列表面 PDMS 無(wú)法固化導(dǎo)致的模型翻制問(wèn)題，同時(shí)進(jìn)一步拓展了 3D 打印在微針陣列設(shè)計(jì)制備領(lǐng)域的應(yīng)用。利用高精度 3D 打印制備的微針陣列擁有較高的分辨率，打印的微針形貌特征保留完整、尺寸均一，為載藥微針的定性與定量分析奠定了基礎(chǔ)。相關(guān)成果以“Design and fabrication of r-hirudin loaded dissolving microneedle patch for minimally invasive and long-term treatment of thromboembolic disease” 為題發(fā)表在《Asian Journal of Pharmaceutical Sciences》期刊上。

在該研究中，首先利用計(jì)算機(jī)輔助的模型設(shè)計(jì)對(duì)目標(biāo)微針陣列進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化，分別按需設(shè)計(jì)了兩款不同參數(shù)的微針陣列模型，如圖 2A所示，考慮到 3D 打印分辨率的限制，繪制微針長(zhǎng)度為 1000 μm，允許微針有 100-200 μm 的長(zhǎng)度損失，設(shè)置微針形狀為五棱錐形，底邊長(zhǎng)度分別為 150 μm 和 100 μm，將微針有序排列成 10 × 10 的微針陣列 (圖 2B)。將設(shè)計(jì)圖紙輸出導(dǎo)入 3D 打印軟件進(jìn)行打印，最終獲得基于光敏樹(shù)脂的微針陣列模型。與設(shè)計(jì)模型相比，微針的高度發(fā)生了100-200μm 的損失 ，但在允許范圍之內(nèi)，微針針體形貌保存完整，不同微針個(gè)體尺寸均一 (圖 2C)，提示高精度 3D 打印在微針陣列模型制備方面具有巨大的應(yīng)用潛力。

圖3.微針模具及 3DMN 制備流程圖

由于以光敏樹(shù)脂為打印材料的微針陣列模型在用 PDMS 進(jìn)行模型翻制時(shí)在接觸表面 PDMS 無(wú)法固化，所以選擇明膠作為中間過(guò)渡材料替代直接使用 PDMS 進(jìn)行微針模具制備，開(kāi)發(fā)一條新的模型制備工藝(圖 3)，并通過(guò)該路線成功制備了微針制備模具。將該模具應(yīng)用于r-hirudin 遞藥系統(tǒng)的制備，通過(guò)連續(xù)的微模型澆鑄并輔以恒溫真空制備r-hirudin 荷載的 3DMN。對(duì) 3DMN 進(jìn)行表征分析并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行微針給藥的藥效學(xué)與藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果顯示 3DMN 給藥可以實(shí)現(xiàn)快速的透皮藥物遞送，血藥濃度在給藥后 0.5 h 達(dá)到峰值 (圖 4D-F)，血液的凝固時(shí)間在 3DMN 給藥后顯著延長(zhǎng) (圖 4A-C)。對(duì) 3DMN 給藥的生物利用度(BA) 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) 3DMN 給藥相對(duì)于皮下注射給藥的BA可達(dá)50% (圖 4G-F)。該結(jié)果初步驗(yàn)證了基于高精度 3D 打印的微針陣列模型制備的 3DMN 在介導(dǎo)透皮 r-hirudin 遞送中的可行性。

圖4. 3DMN 介導(dǎo)的r-hirudin 透皮遞送的體內(nèi)藥效學(xué)與藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究 A-C. 血液凝固時(shí)間隨給藥時(shí)間的變化；D-F. 血清 r-hirudin 濃度隨時(shí)間變化曲線；F. 不同給藥方式血清藥物濃度隨時(shí)間變化曲線 G. 不同給藥方式血清藥物濃度參數(shù)

進(jìn)一步研究 3DMN 在血栓性疾病防治中的應(yīng)用，分別構(gòu)建腎上腺素/Ⅰ型膠原混合物尾靜脈注射誘導(dǎo)的急性肺栓塞動(dòng)物模型和三氯化鐵損傷誘導(dǎo)的腸系膜微動(dòng)脈血栓動(dòng)物模型，將載藥 3DMN 用于動(dòng)靜脈血栓的預(yù)防性治療，研究發(fā)現(xiàn)

3DMN 介導(dǎo)的r-hirudin 用藥可以顯著抑制急性肺栓塞模型小鼠肺部血管栓塞的形成 (圖 5C-D)，提高小鼠的存活率 (圖 5A-B)。此外還觀察到，3DMN 介導(dǎo)的 r-hirudin 用藥同樣可以顯著三氯化鐵損傷誘導(dǎo)的腸系膜動(dòng)脈血栓的形成，降低血栓發(fā)生率 (圖 6)。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明 3DMN 可用于動(dòng)靜脈血栓的預(yù)防性用藥，而高精度 3D 打印技術(shù)的出現(xiàn)不僅豐富了微針多樣性，也為未來(lái)臨床用藥個(gè)體微針量身定制提供了基礎(chǔ)，具有很大的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。

圖5. 3DMN 在預(yù)防急性肺栓塞中的應(yīng)用A-B. 3DMN 給藥對(duì)急性肺栓塞小鼠生存率的影響；C. 小鼠肺部組織石蠟切片 HE 染色；D. 小鼠肺部 CT 掃描圖

圖 6. 3DMN 在預(yù)防腸系膜微動(dòng)脈血栓中的應(yīng)用 A. 血小板在血管損傷部位聚集的體內(nèi)成像；B. 血栓形成率的統(tǒng)計(jì)分析圖；C. 血栓形成長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)分析圖