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美國加州大學圣地亞哥分校的研究人員指出，大約一半的已知致病基因變異是由SNVs引起的，堿基編輯通過引起臨時的RNA或DNA堿基改變，在許多遺傳疾病的治療中具有巨大的潛力。文中通過綜述DNA和RNA堿基編輯器及它們在特異性、效率、精確性和傳遞方面的研究進展，并對新出現(xiàn)的治療機會和挑戰(zhàn)進行了討論，助力精準醫(yī)療領域的下一步發(fā)展。
隨著我們對基因組DNA的主要序列影響人類健康的理解擴大，基因組編輯的治療潛力已經(jīng)出現(xiàn)。大約一半的已知致病基因變異是由單核苷酸變異(SNVs)引起的，這突出了開發(fā)能夠高效糾正SNVs的方法和工具的必要性。堿基編輯是一種用來精確、高效地解決單核苷酸改變的技術，它避免了核酸主干的裂解，在基因組和轉錄組編輯過程中直接對靶堿基進行化學修飾，Biolytic DNA合成儀包括DNA和RNA堿基編輯。Biolytic DNA合成儀單堿基編輯系統(tǒng)在實驗中的應用：
1.單堿基編輯系統(tǒng)在人類疾病治療方面的應用
來自上海交通大學的常興組開發(fā)了dCas9-AIDx堿基編輯系統(tǒng)，并將其應用到腫瘤研究中。在腫瘤疾病治療過程中，基因上特定位點的堿基突變會使部分腫瘤細胞對抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性，如在慢性髓系白血病(chronicmy loidleukemia，CML)的治療中，常使用伊馬替尼藥物來抑制癌細胞中BCRABL激酶的活性，從而抑制白細胞的過度增殖。
但是，在治療過程中，癌細胞會在特定基因序列點突變(如常見的T315I突變)后產(chǎn)生耐藥性，這是目前腫瘤治療的一大障礙。針對這個問題，常興組在CML患者來源的K562細胞系中表達了dCas9-hAIDx的融合蛋白，由于沒有使用UGI，因此AIDx修飾的胞嘧啶C及互補的鳥嘌呤A可以隨機地向其它三種堿基轉變。他們使用sgRNA文庫將dCas9-AIDx靶向到ABL基因的第6個外顯子，誘導點突變的發(fā)生。通過用伊馬替尼藥物篩選，將伊馬替尼耐藥的細胞與篩選前細胞的ABL的第6個外顯子進行深度測序分析，發(fā)現(xiàn)了10個與伊馬替尼耐藥相關的基因突變位點，包括了在臨床中已被證實的T315I突變。該研究證明，可以利用此系統(tǒng)篩選腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性的突變，探究腫瘤疾病的耐藥機制，開創(chuàng)了篩選腫瘤耐藥突變的新方法，結合第二代測序技術在臨床中的應用，將有助于癌癥病人耐藥的早期發(fā)現(xiàn)，提高癌癥病人的生存率。
2.單堿基編輯系統(tǒng)在動物模型方面的應用
目前，大多數(shù)關于單堿基編輯系統(tǒng)的研究報告主要基于細胞實驗，而其在動物模型開發(fā)中的應用將有利于研究人員深入研究疾病發(fā)生和發(fā)展的機理。韓國首爾大學Jin-SooKim組發(fā)表了將rAPOBEC-XTEN-Cas9n-UGI(BE3)系統(tǒng)運用于小鼠疾病模型制備的研究成果。針對小鼠的抗肌萎suo蛋白基因Dmd以及酪氨酸酶基因Tyr，分別設計了特異識別的sgRNA，顯微注射sgRNA和rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI融合蛋白的mRNA或者電轉染sgRNA和rAPOBEC1-Cas9n-UGI蛋白的復合物到小鼠受精卵。
在所獲得的9只Dmd的F0代小鼠中，有5只小鼠產(chǎn)生了靶位點的堿基突變，包括一只純合子突變小鼠(CAG>TAG)。進一步通過免疫染色發(fā)現(xiàn)，在這只純合子Dmd突變小鼠體內(nèi)幾乎檢測不到該蛋白的表達。而通過電轉染gRNA和rAPOBEC-XTEN-Cas9n-UGI融合蛋白的復合物，產(chǎn)生了7只TyrF0后代小鼠中均檢測到靶基因突變，包括3只純合子Tyr突變小鼠。
與Jin-SooKim的發(fā)現(xiàn)類似，也發(fā)現(xiàn)了堿基編輯系統(tǒng)會在胚胎中產(chǎn)生堿基的缺失，并報道了在小鼠胚胎中由堿基編輯系統(tǒng)誘導產(chǎn)生的靶位點處的堿基插入以及臨近位點的脫氨基。由于所用的dCas9-HF2不具有核酸酶活性，他們認為，堿基的插入和缺失是由于胞嘧啶脫氨基后產(chǎn)生的U被堿基切除修復機制識別，并被切除從而產(chǎn)生無堿基位點，無堿基位點再進一步轉化成DNA雙鏈損傷，從而導致堿基插入和缺失的產(chǎn)生。以上兩項研究結果充分證明了單堿基編輯系統(tǒng)能高效地用于制備疾病動物模型，但仍需進一步優(yōu)化來提高特異性及降低堿基插入和缺失的產(chǎn)生。
3.單堿基編輯系統(tǒng)在植物方面的應用
轉基因技術在改良作物性狀方面已經(jīng)做了大量的工作，但由于外源基因的導入和公眾科普的缺乏，使得轉基因作物的推廣和應用存在較大難度。作物在漫長的人工選育過程中，人類通過人工選擇的方式定向選育具有優(yōu)良性狀的基因突變株，但該過程耗時耗力且不可控。利用同源重組技術，可以獲得定點修飾的優(yōu)良植物株，但由于同源重組的效率太低，因此可行性不高。單堿基編輯技術在人細胞中高效編輯單個堿基的結果提示，以通過該系統(tǒng)在農(nóng)作物中的進行定點可控的基因編輯，進而快速、高效地獲得優(yōu)良性狀的植株。
研究還發(fā)現(xiàn)在作物中胞嘧啶核苷脫氨酶的作用活性窗口為7個核苷酸序列，從距離PAM最遠端數(shù)起的第3～9位核苷酸，這相對于在動物細胞中的編輯窗口更廣。嘗試采用土壤桿菌為載體，攜帶Cas9n-XTEN-rAPOBEC1-UGI融合蛋白和sgRNA，編輯水稻內(nèi)一種衰老控制基因OsCDC48。研究結果顯示，單堿基編輯效率在5.0%～32.5%，靶位點處沒有發(fā)現(xiàn)核苷酸序列的隨機插入或缺失，而且預測可能的脫靶位點處也沒有發(fā)現(xiàn)突變。同一時間，中科院上海生命科學研究院的朱健康團隊和中國農(nóng)業(yè)科學院作物研究所的夏蘭琴團隊也分別報道了運用單堿基編輯系統(tǒng)對水稻基因進行單堿編輯。這三個獨立的研究表明，單堿基編輯系統(tǒng)可以在農(nóng)作物中取得高效的編輯效率，為改良作物品種帶來新希望。
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