国产精品视频一区二区三区四,亚洲av美洲av综合av,99国内精品久久久久久久,欧美电影一区二区三区电影

產(chǎn)品推薦:氣相|液相|光譜|質(zhì)譜|電化學(xué)|元素分析|水分測定儀|樣品前處理|試驗(yàn)機(jī)|培養(yǎng)箱


化工儀器網(wǎng)>技術(shù)中心>解決方案>正文

歡迎聯(lián)系我

有什么可以幫您? 在線咨詢

液相色譜分析方法開發(fā),你學(xué)會(huì)了嗎?

來源:蘇州邦鑫電子技術(shù)有限公司   2022年04月18日 09:23  

高效液相色譜分析:是一種高效,快速,準(zhǔn)確的分離分析方法,廣泛應(yīng)用于石油化工、生命科學(xué)、環(huán)境、醫(yī)藥及食品安全行業(yè)。分析方法的開發(fā)與驗(yàn)證在不同行業(yè)有不同的要求,化學(xué)醫(yī)療行業(yè)對(duì)于質(zhì)量的控制要求非常嚴(yán)格,高效液相色譜分析方法是質(zhì)量控制的重要手段,其開發(fā)與驗(yàn)證對(duì)于其它行業(yè)來說也有很好的借鑒意義。


液相色譜主要有親水色譜、正相色譜、反相色譜、離子交換色譜、凝膠滲透色譜/體積排阻色譜等幾種色譜分離模式。其中反相色譜是到目前為止*通用的 HPLC 方法,大約占所有方法的 60%,將近 95% 的色譜工作者都在使用。那么本文我們主要來講反相色譜分析方法的開發(fā)。


反相色譜的原理:分析物與疏水固定相之間發(fā)生非極性、非特異性相互作用,即分析物在極性流動(dòng)相和非極性固定相之間分配,與正相色譜相反。反相色譜柱通常使用的固定相有C18、C8苯基。反相色譜系統(tǒng)通常使用的流動(dòng)相有:a. 水,可含緩沖液,或用酸或堿調(diào)節(jié)pH , b . 可與水混溶的有機(jī)溶劑。


如何來開發(fā)一個(gè)合理可行的反相色譜分析方法,這其實(shí)是每一個(gè)色譜工作者必須面對(duì)并解決的問題。分析方法的開發(fā)其實(shí)主要是選擇合適的色譜柱、流動(dòng)相、檢測波長來得到一個(gè)初步分析方法,后面再做其他方面的優(yōu)化,使色譜峰之間的分離度、峰形、峰高、峰寬滿足要求。下面我們就來仔細(xì)講講反相色譜分析方法的開發(fā)。


一、色譜柱的選擇

高效液相色譜分析中,色譜柱的選擇直接影響了分離效果的好壞,選擇合適的色譜柱可以縮短方法開發(fā)所需的時(shí)間,并且使方法更具穩(wěn)定性。但是我們要清楚現(xiàn)在商品化的液相色譜柱比比皆是,根據(jù)色譜柱的參數(shù)可以給我們提供一個(gè)初步的選擇,但由于各個(gè)儀器廠商的填料技術(shù)和鍵合技術(shù)都有差異。即使都是C18柱,不同品牌、同一品牌不同系列都有不同的功能,有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。那就要求我們要對(duì)各種類型的色譜柱做充分的了解之后,才能做出合適的選擇。下面我們來講講如何選擇色譜柱吧!

01
填料孔徑的選擇

選擇色譜柱時(shí)我們首先要考慮的就是選擇填料的孔徑大小,這怎么來選擇呢,那么我們就要對(duì)自己所分析的物質(zhì)做充分的了解,首先要知道的就是被分析物的分子量,對(duì)于分子量<2000的小分子物質(zhì)我們選擇孔徑80 - 120 孔徑的填料, 而對(duì)于分子量 >2000多肽和蛋白質(zhì)類物質(zhì)則需要300 孔徑的填料對(duì)其進(jìn)行等度或梯度分離。選擇到合適孔徑大小的填料之后我們才能夠保證目標(biāo)分子能進(jìn)入填料,在空隙中與疏水性固定相發(fā)生相互作用。

02
鍵合相的選擇

選擇完填料的粒徑之后,我們就到了選擇鍵合相的環(huán)節(jié),這一步呢我們就需要多做實(shí)驗(yàn)多試,大多數(shù)色譜工作都是從C18鍵合相開始的,在這里呢,我也建議大家將C18作為開始分析的鍵合相,因?yàn)槠淇梢?大限度地保留中等極性到非極性化合物。如果用 C18 鍵合相不能優(yōu)化分離度,或要分析的是蛋白質(zhì),或用常規(guī)反相溶劑很難從C18上洗脫的強(qiáng)疏水化合物,這時(shí)候可以考慮使用短鏈鍵合相如:C8、C3。

03
填料粒徑的選擇

色譜柱填料的粒徑,影響色譜分離度。粒徑越小,分離越快,柱效越高,但柱壓力越高,柱容易被污染,導(dǎo)致柱壽命降低。常見分析柱通常使用5um填料,復(fù)雜的多組分樣品分離一般使用3.5um粒徑,更大內(nèi)徑的制備色譜柱通常使用更大的粒徑。如果固定相選擇是正確,但是分離度不夠,那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3.5um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍,因此如何選擇填料粒徑需要我們根據(jù)實(shí)際情況而定。

04
色譜柱的長度選擇

在這里我們要清楚柱越長,分離度越高,但柱壓更高,分離所需時(shí)間更長;如果想要得到較高的分離度,在壓力和時(shí)間允許的情況下盡量選擇長柱,如250mm。如果想要縮短分析時(shí)間并且對(duì)分離度的要求不高,建議大家使用短柱,可以節(jié)約時(shí)間,如50mm。

二、流動(dòng)相的選擇

一般來說,反相LC 的流動(dòng)相包括水和作為改性劑的乙腈或甲醇。改性劑還有四氫呋喃(THF)和異丙醇。反相色譜中流動(dòng)相中水相的pH和離子強(qiáng)度在開發(fā)對(duì)條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對(duì)于離子型化合物,典型樣品的保留隨 pH 改變而明顯變化。在這類反相系統(tǒng)中,控制 pH 對(duì)于保留和選擇性的穩(wěn)定非常重要。通常在 pH 2 到 4 條件下,保留時(shí)間對(duì)pH的微小改變穩(wěn)定性*高,因此色譜工作者將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開發(fā)的起始pH,包括堿性化合物和一般的弱酸。

為了有較好的重現(xiàn)性,所用的 pH 應(yīng)高于或低于待分離溶質(zhì)pKa或pKb上下一個(gè)pH單位。如果不清楚分析物的pKa,建議大家測試一種以上流動(dòng)相 pH 可提供*好結(jié)果。大多數(shù)反相柱都可以在pH 2-8條件下使用,這樣為分離選擇*佳流動(dòng)相 pH 提供了較寬的范圍。流動(dòng)相 pH 對(duì)色譜分離的影響有多種方式。根據(jù)所分析的化合物,pH可能影響選擇性、峰形和保留。如果是可離子化的化合物,如酸或堿,保留因子和選擇性隨 pH的改變變化非常明顯,如果是非極性較強(qiáng)或中性的化合物,pH 對(duì)分離度和保留的影響一般不明顯。

在開發(fā)可離子化分析物的分析方法時(shí),我們一定要清楚非離子化形態(tài)的分析物比離子化形態(tài)的分析物保留更好,所以我們調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值,其目的就是防止可離子化分析物離子化。對(duì)于酸性分析物而言,應(yīng)選擇低 pH 緩沖液流動(dòng)相,以防止分析物離子化。我們了解了分析物的 pKa,才能夠有效地選 擇流動(dòng)相 pH。緩沖范圍應(yīng)在其緩沖液離子 pK 值的 +/-1 pH 單位,使流動(dòng)相的優(yōu)化具有一定的靈活性。例如, 醋酸鹽的 pKa 為 4.8,緩沖范圍從 pH 3.8-5.8。甲酸鹽的酸性較大,緩沖范圍為 pH 2.8-4.8。對(duì)于堿性化合物而言,在高 pH 條件下才能得到其非離子化形態(tài),但這對(duì)色譜柱不利。但許多堿性化合物在 低 pH 條件下的保留就已經(jīng)足夠了。因此,雖然非離子化形態(tài)能得到更高的保留,但這對(duì)與所有的堿性化合物并不是實(shí)用和必要的。在流動(dòng)相的選擇這一塊以下幾點(diǎn)相當(dāng)重要,恕小編冒昧,請(qǐng)大家爛熟于心哦。

03
關(guān) pH 的幾點(diǎn)注意事項(xiàng)
  • 離子抑制形態(tài)下的分析物具有更好的保留(例如,低pH下的酸和高pH下的堿) 。

  • 在中性和較高pH下,硅膠上的硅醇基發(fā)生離子化,增加了堿性分析物的保留(例如,可能發(fā)生離子交換相互作用) 。

  • 在方法開發(fā)過程中,可選擇流動(dòng)相pH對(duì)保留和選擇性進(jìn)行優(yōu)化。

  • 為延長柱壽命,避免使用j端 pH 值(*或極低)??梢允褂镁彌_液幫助調(diào)節(jié) pH 值。緩沖液可以保持pH不變,提高重現(xiàn)性。

  • 選擇流動(dòng)相改性劑時(shí),一定要考慮檢測器;與 UV 檢測器匹配良好的改性劑不一定與 MS 檢測器兼容。

02
緩沖液選擇
  • 成功的HPLC分離不必*抑制離子化,通常在流動(dòng)相緩沖容量足夠的情況下,90% 的抑制即可。

  • 流動(dòng)相的緩沖容量與配制的摩爾濃度,以及洗脫液的 pH 與緩沖離子 pK 的接近程度有關(guān) 通常在高于或低于緩沖離子 pK 1 個(gè) pH 單位內(nèi),可以起到緩沖效果。

  • 色譜操作者也可以選擇非緩沖的流動(dòng)相進(jìn)行 pH 調(diào)節(jié)。這對(duì)于酸性分析物而言也是常用的,用單一的酸溶液進(jìn)行色譜分離,酸的濃度應(yīng)足以使pH比需要值低得多,以防止化合物離子化。

  • 對(duì)于堿性物質(zhì)的分離,選擇是比較有限的。TEA(三乙胺)不能*溶于水,而且 pK (11) 很高,氨本身可以*溶于水,但對(duì)大多數(shù)色譜柱來說pK值過高。

  • 測定流動(dòng)相pH時(shí),要在水相與有機(jī)改性劑混合之前在水相中進(jìn)行測定,以確保得到準(zhǔn)確而可重復(fù)的結(jié)果。

  • 選擇緩沖鹽時(shí)注意緩沖鹽與檢測的相容性,對(duì)于UV檢測器來說,在目標(biāo)波長下緩沖液應(yīng)*透光。緩沖液UV截止波長*好低于220 nm。

03
緩沖液配置過程中的注意事項(xiàng)
  • 流動(dòng)相會(huì)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室中的混合方式而不同。例如,如果要配制甲醇/水=50/50的混合溶劑,應(yīng)先量取各自的體積,分別置于潔凈的玻璃容器中,然后再將其混合,因?yàn)榧状己退旌先軇┑目傮w積大于各自體積之和。如果在同一個(gè)容器中混合,混合溶劑的總體積就會(huì)不同。

  • 流動(dòng)相脫氣也很重要。在流路中,溶解在溶劑中的氣體可能逸出,形成氣泡,并有可能干擾泵或檢測器的性能。因此我們?cè)谂渲煤昧鲃?dòng)相之后一定要對(duì)其進(jìn)行脫氣處理,脫氣處理完之后切記不要再對(duì)其進(jìn)行劇烈振搖。

  • 使用正常工作的 pH 計(jì)。按照目標(biāo)pH值校正pH計(jì)。用pH計(jì)對(duì)pH進(jìn)行可靠的測量非常重要。

  • 確保試劑盡可能新鮮。

  • 先把固體溶解在非常接近終體積的液體中。調(diào)節(jié)pH到目標(biāo)值后,再添加液體使溶液達(dá)到目標(biāo)體積。

  • 緩沖液配制完成后,在 HPLC 系統(tǒng)上使用之前要進(jìn)行過濾,去除水或鹽中可能存在的顆粒。大多數(shù)HPLC應(yīng)用都使用0.45 m濾膜;UHPLC則使用0.22 m濾膜。

三、波長的選擇

做分析方法開發(fā)我們需要二極管陣列檢測器,選擇檢測波長和做色譜峰純度檢查,通過色譜 峰純度檢查來保證主峰里沒有掩蓋其它雜質(zhì),做純度檢測對(duì)波長選擇的要求比較簡單,原則 是把盡量多的雜質(zhì)在色譜圖上體現(xiàn)出來。很多雜質(zhì)只有在低波長下才有紫外吸收,所以我們 選擇盡可能低的波長,乙腈的截止波長在 190~195nm,用乙腈做流動(dòng)相檢測波長可以選擇 在 210~220nm。也有公司要求分別選取產(chǎn)品紫外吸收*強(qiáng)的波段和 210~220nm 兩個(gè)波段做 對(duì)比,哪個(gè)純度低以哪個(gè)為準(zhǔn),這樣可以更嚴(yán)格的控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

四、分析方法的優(yōu)化
01
改變梯度斜率

更緩的梯度斜率可以提高分離度,降低梯度斜率將降低靈敏度, 更陡的梯度斜率可能壓縮色譜峰,經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致分離度的降低, 增加梯度斜率將增加靈敏度, 改變梯度斜率時(shí)要平衡峰高與分離度的關(guān)系。

02
改變柱溫

溫度會(huì)影響色譜分析中的每一個(gè)化學(xué)過程,例如增加溫度會(huì)降低移動(dòng)相的粘度,如果流動(dòng)速度恒定將導(dǎo)致系統(tǒng)背壓降低,高溫將改變固定相和流動(dòng)相之間的分配速率,然而由于提高了被測物分散性,會(huì)加快優(yōu)化線性速度。對(duì)溫度變化敏感的化合物,溫度的微小變化都會(huì)導(dǎo)致選擇性發(fā)生*變化。在這里我們要注意選擇柱溫一要考慮色譜柱的承受范圍,二要考慮該溫度下,檢測成分是否會(huì)降解。



免責(zé)聲明

  • 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
  • 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí),必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
  • 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題,請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
企業(yè)未開通此功能
詳詢客服 : 0571-87858618
社会| 瑞金市| 吉首市| 迭部县| 来安县| 绥滨县| 平山县| 稻城县| 宜州市| 岢岚县| 五指山市| 邹平县| 内丘县| 卢氏县| 特克斯县| 马鞍山市| 连南| 胶南市| 田林县| 合水县| 樟树市| 淮阳县| 海南省| 平陆县| 桦甸市| 菏泽市| 涟源市| 陆河县| 陇西县| 大荔县| 九寨沟县| 农安县| 灵寿县| 通海县| 西吉县| 新兴县| 阿巴嘎旗| 故城县| 浪卡子县| 汕头市| 勐海县|