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二手PCR儀是一種核酸檢測和定量分析的新方法，可以作為傳統(tǒng)實時定量PCR的替代方法，以實現(xiàn)一致定量及稀有等位基因的檢測。數(shù)字PCR的工作原理在于將DNA或cDNA樣品分割為許多單獨、平行的PCR反應，部分這些反應包含了靶標分子(陽性)，而其他不包含(陰性)。單個分子可以被擴增一百萬倍或更多。在擴增期間，TaqMan化學試劑及染料標記探針可用于檢測特定序列的靶標。當不存在任何靶標序列時，沒有信號累積。PCR分析后，陰性反應片段用于生成樣品中靶標分子的一致計數(shù)，而無需標準品或內標。
二手PCR儀每個循環(huán)包括這三個關鍵步驟。通常，它運行40個周期。
1、幼化：雙鏈DNA通過高溫孵育“溶解”成多肽鏈，單鏈DNA的二級結構松動。一般DNA聚合酶可以承受較大的溫度(一般為95℃)。如果免費模板的GC含量高，時間會有所提高。
2、熱處理：在整個熱處理過程中，與開放閱讀框的緊密接觸有機會引起雜交雜交。因此，解鏈溫度(TM)應根據(jù)計算個人所得稅的引物設計，并選用合適的溫度(一般比引物設計的TM低5℃)。
3、擴寬：70-72℃中間，DNA聚合酶活性為，引物加寬速度可達每秒100個堿基。隨即，熒光定量PCR中擴增的精彩畫面就小了。通常，該步驟與溫度為60°C的熱處理步驟相結合。使用隨機引物設計或寡核苷酸(DT)和隨機引物設計化學品。用于cDNA轉化的溫度取決于所選的RT酶。逆轉錄后，將約10%的cDNA轉移到單獨的試管中進行及時的熒光定量PCR。
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