單克隆分離是建立穩(wěn)定細胞系的重要環(huán)節(jié),因而在現(xiàn)代生物技術和醫(yī)藥研發(fā)領域中應用廣泛,構建穩(wěn)定細胞系的常用方法有質粒轉染法和病毒侵染法,兩種方法都需要借助抗生素篩選,通過單細胞克隆分離獲得穩(wěn)定、遺傳特性一致的細胞群。
通過單細胞克隆分離和抗生素篩選,獲得表達效率高、整合穩(wěn)定的細胞群,最終構建成穩(wěn)定細胞系;而病毒侵染法則是通過將攜帶目的片段的病毒,常用的如慢病毒,轉導入細胞,再通過單細胞克隆和抗生素篩選,獲得穩(wěn)定細胞系。
目前常規(guī)的單克隆分離技術主要包括有限稀釋法、克隆環(huán)法和顯微操作法。有限稀釋法是通過將細胞懸液連續(xù)梯度稀釋,使細胞培養(yǎng)板的一個孔中僅有1個細胞,再經過兩周左右時間增殖,形成細胞群,再經過驗證獲得穩(wěn)定克??;克隆環(huán)法是通過在10-15cm的細胞培養(yǎng)皿中,將細胞接種低密度,使分散的單個細胞各自增殖成細胞群,用克隆環(huán)方式與周圍的細胞隔離開,通過胰酶消化,轉到新的孔板中繼續(xù)培養(yǎng)擴增,并檢測驗證而獲得穩(wěn)定克隆;顯微操作法是借助顯微鏡,在放大的視野下挑取單細胞,再轉至培養(yǎng)孔中,逐漸擴增獲得單克隆。
哺乳動物細胞通過分離、稀釋接種,培養(yǎng)在適宜于單細胞生長的培養(yǎng)液中,形成細胞克隆,運用這項技術可以制作細胞成活曲線,即在接種相同數(shù)量細胞的培養(yǎng)瓶中,加入不同濃度的化學藥品,或照以不同劑量的射線,觀察其對細胞的聽見害程度,由此可以在哺乳類細胞中進行誘變試驗及分離突變細胞。
方法:
a、在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細胞(小鼠腹腔細胞)單層。
b、臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻,配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液,45℃水浴中溫育。
c、吸去平皿上層培養(yǎng)液,加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml,室溫10分鐘。
d、取雜交瘤細胞懸液1ml,加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻,鋪于上層。
e、37℃、7.5%濕潤培養(yǎng)7-14天,克隆生長至2mm時,用毛細吸管吸出克隆,直接轉種于含有飼養(yǎng)細胞的24孔板,擴大培養(yǎng)。
f、吸取上清,檢測抗體,陽性孔可繼續(xù)克隆化,或擴大培養(yǎng)、凍存。
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