禽流感病毒H5N1熒光PCR檢測試劑盒

禽流感病毒H5N1亞型核酸檢測試劑盒

（RT-PCR熒光探針法）

【產(chǎn)品概述】

本試劑盒針對AIV-H5N1高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含AIV-H5N1基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結果的定性分析。

【試劑盒組成】

【儲存條件及有效期】

-20℃避光保存，避免反復凍融，有效期6個月。

【適用儀器】

ABI7300、ABI7500、LightCycler 480、iCycleriQ5、CFX96、SLAN等熒光定量PCR儀。

【樣本采集、存放及運輸】

u 樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集；

u 存放：樣本在2~8℃條件下保存應不超過72h，-70℃以下可長期保存，但應避免反復凍融（最多凍融3次）；

u 運輸：采用冰壺或泡沫箱加冰密封進行運輸。

【自備試劑】

核酸提取試劑，如QIAGEN公司的 RNA核酸提取試劑盒，也可選擇其他合適的核酸提取產(chǎn)品。

【使用方法】

注：所有試劑使用前需*解凍，混合均勻，6,000rpm離心數(shù)秒后使用。

1. 樣本處理（樣本處理區(qū)）

待檢樣本的核酸提取可采用病毒RNA提取試劑盒或自動化核酸提取儀等，具體提取方法請參照相關說明書；陽性對照及陰性對照無需提取，可直接使用。

2. 擴增試劑準備（PCR前準備區(qū)）

取N個（N=陰性對照+待檢樣本+陽性對照）PCR反應管，每管分別加入PCR反應液17.5 μl、混合酶液2.5 μl (也可根據(jù)每頭份用量計算N+1份PCR反應液、混合酶液所需總量，兩者混勻離心后分裝20 μl至單個PCR反應管)。

      將所有PCR反應管于6,000rpm離心30s，轉移至樣本處理區(qū)。

      3. 加樣（樣本處理區(qū)）

   在上述的PCR反應管中分別加入待檢樣本RNA提取物、陰性對照和陽性對照各5 μl，蓋緊管蓋，于6,000rpm離心10s，轉移至擴增區(qū)。

   * 注意事項：建議加樣順序是陰性對照、待檢樣本、陽性對照。

      4. PCR擴增（擴增區(qū)）

1)      儀器設置（以ABI Prism 7500為例）

將PCR反應管放入PCR儀內(nèi)，按照對應順序設置陰性對照(NTC)、陽性對照(Standard)及待檢樣本(Unknown)。

FAM通道采集AIV-H5熒光信號，HEX通道采集AIV-N1熒光信號。Quencher Dye為None，參比染料(Passive Reference)為 None。

2)      擴增程序

        42℃ 10min

        95℃ 3min

95℃  5sec

55℃  40sec

        95℃  5sec

        55℃  40sec

        40Cycles中55℃采集熒光信號，反應體系為25 μl。

【結果分析條件設定】

u 基線（Baseline）設定：應選擇該次實驗指數(shù)擴增前所有樣本熒光信號比較穩(wěn)定的一段區(qū)域（所有樣本熒光信號無較大波動），起始點（Start）應避開熒光采集起始階段的信號波動，終止點（End）應比最早出現(xiàn)指數(shù)擴增的樣本Ct值減少1~3個循環(huán)，建議基線設為3~15。

u 閾值(Threshold)設定：將閾值線設定在剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。

【質控標準】

1.   陰性對照的檢測結果應為陰性，Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期；

2.   陽性對照的檢測結果應為陽性，有典型S型擴增曲線或Ct值≤35；

3.   以上要求需在一次實驗中同時滿足，否則該次實驗視為無效。

【結果判斷】

1.   陽性：標本檢測結果Ct值≤35并有明顯指數(shù)增長期；

2.   可疑：有明顯的指數(shù)擴增期，且35＜Ct≤38，此時樣本為可疑樣本；對于可疑樣本建議復核一次，若復核結果Ct≤38且有指數(shù)擴增期，則判定為陽性，否則判定為陰性；

3.   陰性：無指數(shù)擴增期，Ct＞38或無Ct值均判定為陰性樣本。

【對檢驗結果的解釋】

【試劑盒使用注意事項】

1.   有關實驗室管理規(guī)范請嚴格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關基因擴增檢驗實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

2.   本試劑盒僅用于體外檢測。

3.   實驗請嚴格分區(qū)操作：

第一區(qū)：PCR前準備區(qū) — 準備擴增所需試劑；

第二區(qū)：樣本處理區(qū) — 待測樣本和對照品處理；

第三區(qū)：檢測區(qū) — PCR擴增檢測。

4.   各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用，避免污染，實驗后即請清潔工作臺；

5.   試劑盒內(nèi)各試劑使用前，充分融化后請稍事離心。

6.   在－20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物，應在加樣前置室溫解凍，作短暫離心后使用。

7.   分裝有反應液的檢測管裝入密實袋內(nèi)再轉移至樣本區(qū)。

8.   加樣時應使樣品*落入反應液中，不應有樣品粘附于管壁上，加樣后應盡快封上檢測管蓋。

9.   擴增完畢立即取出檢測管，密封在專用塑料袋內(nèi)，丟棄于指D地點。

10.   反應液分裝時應盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄露污染儀器。

11.   實驗中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi)，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。

12.   工作臺及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進行消毒。

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