重組腺相關(guān)病毒有組織特異性高、安全性好、免疫原性低等等優(yōu)點(diǎn)，目前被作為基因治療中常用的病毒載體。行業(yè)內(nèi)常采用三質(zhì)?；蚨|(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，進(jìn)而獲得不同血清型的重組AAV載體。其中Cap基因編碼VP1、VP2和VP3三種衣殼蛋白和組裝激活蛋白。VP1與病毒從體內(nèi)逃逸有關(guān)，對感染性至關(guān)重要；VP2對于組裝或者感染不可少；VP3核心保守序列β-桶結(jié)構(gòu)決定了不同血清型AAV與宿主細(xì)胞作用受體的差異，三者組裝成直徑約25nm的二十面體病毒顆粒，形成病毒衣殼，充當(dāng)病毒基因傳遞載體。
 

圖1：AAV病毒及組成示意圖

AAV衣殼屬性是影響病毒感染活性和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因素，其比例、鑒別、純度、空殼率影響藥物效能和效價強(qiáng)度。因此在基因治療產(chǎn)品的整個開發(fā)過程中，需要對AAV衣殼的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及其蛋白質(zhì)組成進(jìn)行充分表征和監(jiān)測，為確保藥物的安全性和有效性。ELISA、免疫印跡法常用于確定功能和組成信息，但是無法做到AAV衣殼蛋白的表征。SDS-PAGE和銀染常用于衣殼蛋白研究，但是檢測時間較長，且常常發(fā)生凝膠過熱、過載、染色/脫色標(biāo)準(zhǔn)化不足等問題，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差，檢測通量不大。此外，分析型超速離心方法（AUC）方法和質(zhì)譜方法也被用于VP蛋白分析，但分析通量有限。因此，行業(yè)內(nèi)亟需尋找一種高通量、、靈敏的方法，用于衣殼蛋白組成、純度、比例及糖基化等表征。
 

PerkinElmer LabChip GXII Touch微流控毛細(xì)管蛋白分析系統(tǒng)配套ProteinEXact芯片和試劑盒被廣泛用于AAV衣殼蛋白分析。65秒內(nèi)運(yùn)行150 nl樣品即可完成樣品分析。靈敏度比銀染靈敏度高一個數(shù)量級，可低至0.2ng/uL。作為一種全自動和高通量的檢測方法，為AAV顆粒質(zhì)量研究帶來了一種定量和可重復(fù)的方法。其檢測原理是：帶電荷樣品在電場中遷移，結(jié)合的熒光基團(tuán)會被LIF檢測器檢測。一張芯片整合了SDS-PAGE的所有流程：上樣，分離、染色、脫色和檢測，直接從96 孔板或384孔板采樣，通過軟件即可快速實(shí)現(xiàn)蛋白或核酸分析，使用方便且可無人值守，化繁為簡，同時檢測通量和數(shù)據(jù)質(zhì)量，具有定量研究AAV蛋白的潛力。是一種快速、定量且可重復(fù)的AAV分析替代方案，目前已用于蛋白分子量、純度、比例和穩(wěn)定性分析、糖基化以及AAV血清型分析等等。
 

圖2：PerkinElmer LabChip GXII Touch儀器及工作原理 A.儀器外觀圖；B.芯片及進(jìn)樣針；C.熒光圖像顯示蛋白質(zhì)如何在微流體通道中分離和脫色；D. ProteinEXact試劑盒

衣殼蛋白純度、比例研究

實(shí)驗(yàn)人員使用PerkinElmer LabChip GXII Touch系統(tǒng)對AAV8衣殼蛋白進(jìn)行了定量分析，并對VP1、VP2、VP3和雜蛋白大小、分布、濃度和含量百分比進(jìn)行了計算。該結(jié)果可以與文獻(xiàn)報道的純化樣品SDS-PAGE銀染結(jié)果進(jìn)行了直觀比較。
 

圖3：變性的AAV8微流控毛細(xì)管電泳結(jié)果與精純方法SDS-PAGE銀染對比結(jié)果
 

那么，該系統(tǒng)檢測重復(fù)性如何呢？在對同一樣品進(jìn)行12次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)對VP1、VP2、VP3檢測具有良好重復(fù)性。取12次實(shí)驗(yàn)的VP1、VP2和VP3濃度的平均值，比值為1:1.7:11.3，與預(yù)期比例1:1:10接近。

圖4：變性AAV8的12次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總

AAV血清型分析

通過對VP1、VP2和VP3峰的分析，還可以用于AAV血清型確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)中前處理必須確保衣殼蛋白解離，以便于血清型分析?；诟鞣N血清型AAV的VP分子量大小和組成差別，可以通過LabChip GXII系統(tǒng)，對AAV2、AAV5、AAV8血清型進(jìn)行了良好的區(qū)分。
 

圖5.不同的AAV血清型（AAV2、AAV5、AAV8）衣殼蛋白微流控毛細(xì)管電泳峰圖

穩(wěn)定性及聚體動態(tài)研究

AAV衣殼蛋白解離溫度不同，因此AAV的穩(wěn)定性也不相同。在對AAV2、AAV8和AAV9的空殼研究實(shí)驗(yàn)中，樣品加入SDS80℃反復(fù)加熱充分破壞衣殼，使用PerkinElmer LabChip GXII毛細(xì)管電泳系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)解離的AAV8顆粒有三個峰，部分破碎的衣殼可以形成不同蛋白質(zhì)分子量聚集體：單體，二聚體，三聚體等混合物以及完整顆粒。該系統(tǒng)的檢測時效性和通量可以為衣殼解離或組裝動態(tài)研究提供了極大的便利和數(shù)據(jù)支撐。
 

圖6.AAV8熱穩(wěn)定動力學(xué)數(shù)據(jù)（a-二聚體和三聚體同時存在；b-只有二聚體存在）

AAV糖基化分析

衣殼蛋白的翻譯后修飾對病毒感染嗜性和免疫原性有較大的影響。在以上峰圖中也可以清楚看到了VP3的“肩峰”，這個跟文獻(xiàn)報道一致，Sara等也發(fā)現(xiàn)了AAV2衣殼蛋白的糖基化，并推測了衣殼蛋白表面的四個糖基化位點(diǎn)。為了證實(shí)該推測，研究人員對AAV2，AAV8和AAV9衣殼蛋白進(jìn)行了PNGaseF酶切去糖基化。結(jié)果顯示去糖基化前后的確有分子量變化，處理前分子量VP1、VP2、VP3分別為115kDa、94kDa、81kDa，處理后為113kDa、92kDa、79kDa，大約減小2kDa，與附著在衣殼蛋白上的聚糖的平均分子量一致。凝膠圖上酶切前后分子條帶也顯示了位移。Aloor等的報道在AAV8中發(fā)現(xiàn)了多個N-糖基化位點(diǎn)，質(zhì)譜分析鑒定到了N499位點(diǎn)N-糖基化。Mary等對AAV中多種PTM修飾及糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了匯總。
 

圖7.AAV8衣殼蛋白去糖基化及分析
 

以上，我們介紹了使用PerkinElmer LabChip GXII Touch 微流控蛋白分析系統(tǒng)搭配ProteinEXact芯片和試劑盒進(jìn)行AAV樣品的分析檢測，證明了該平臺提供病毒蛋白分析的能力，可以為重組病毒顆粒衣殼蛋白組成、比例、純度、糖基化分析提供了一套重復(fù)性高和度好的表征新方法，還為AAV血清型鑒定提供了一種可靠的方法。
 

在PerkinElmer LabChip GXII Touch微流控毛細(xì)管蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)上使用ProteinEXact檢測方法，可以實(shí)現(xiàn)靈敏度高、重復(fù)性好的蛋白質(zhì)定量和分子量檢測。非常適合于對檢測精度有較高要求的生物制藥上下游樣品分析，以及和基因治療樣品的高分辨率、可對AAV屬性進(jìn)行重復(fù)性、高通量的表征。此外，該方法還可以用于雙特異性抗體表征分析，這個應(yīng)用我們下一期再來繼續(xù)聊。

PerkinElmer LabChip GXII Touch系統(tǒng)特點(diǎn)

• 標(biāo)準(zhǔn)化、高質(zhì)量的數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)，重現(xiàn)性好

• 快速高效：1分鐘以內(nèi)，比普通CE快45-70倍

• 可應(yīng)用于多個環(huán)節(jié)：表達(dá)體系/條件的篩選、純化過程的優(yōu)化、劑型、生產(chǎn)過程及產(chǎn)品放行

• 可提供多方面的定量數(shù)據(jù)：濃度、純度、糖型、聚集體、電荷異質(zhì)性等等

• 符合相關(guān)法規(guī)要求

• 領(lǐng)域內(nèi)的用戶已采用并給予高度評價

ProteinEXact芯片和試劑盒特點(diǎn)

• 芯片可重復(fù)使用

• 低上樣量2uL

• 片段大小性高：＜2%

• 片段大小分辨率高：±10%分子量差異

• 靈敏度高：0.2ng/μL

• 樣品分析時間短：65 sec

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