骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化

1.1 接種干細(xì)胞

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照2.0x 10e4cells/cm2的細(xì)胞密度接種至培養(yǎng)器皿，于37°C,5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至匯合度90~100 %，棄掉上清，加入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)液。NOTE:如細(xì)胞貼壁性較差，建議使用0.1%明膠對(duì)培養(yǎng)底面進(jìn)行包被。

1.2 細(xì)胞分化誘導(dǎo)

于37°C, 5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約3天，更換為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基維持液，培養(yǎng)1天后，再更換為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)3天。按照以上換液頻率誘導(dǎo)14~21天,并注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。根據(jù)細(xì)胞誘導(dǎo)形成的脂滴數(shù)量和大小，決定終止細(xì)胞誘導(dǎo)的時(shí)間，并進(jìn)行染色鑒定。

2. 染色鑒定

2.1 細(xì)胞固定

吸去培養(yǎng)基使用適量1xPBS清洗一次,棄去后取適量4%中性甲醛溶液覆蓋培養(yǎng)器皿底面,室溫固定30~60min,棄去固定液再使用1xPBS清洗兩次。

2.2 油紅0染色

取生理鹽水或1xPBS與油紅O原液配制油紅0工作液(油紅0原液:生理鹽水=3:2)，現(xiàn)用現(xiàn)配。配制后可對(duì)油紅0工作液進(jìn)行離心，以沉淀染色液中的過飽和析出物。向清洗干凈的誘導(dǎo)孔內(nèi)加入適量油紅0工作液,靜置染色30min。吸走油紅0工作液，用1xPBS清洗兩次，并加入適量1xPBS避免細(xì)胞干燥。

2.3 誘導(dǎo)評(píng)估

顯微鏡下觀察成脂染色效果，并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評(píng)估。誘導(dǎo)成功時(shí)，脂滴與油紅0染料結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。NOTE:干細(xì)胞的成脂分化水平因細(xì)胞類型、細(xì)胞供體來源，培養(yǎng)條件、細(xì)胞代次、細(xì)胞狀態(tài)和分化時(shí)間等因素而異。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化 (平面誘導(dǎo))

1. 細(xì)胞分化誘導(dǎo)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化下來計(jì)數(shù)，成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)液重懸細(xì)胞，離心后調(diào)整細(xì)胞密度密度1.0~2.0x 10e7cells/mL。吸取20 μl細(xì)胞懸液(約2.0~4.0x 10e5個(gè)細(xì)胞)懸滴至24孔板中間。置于37°C， 5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)2~3 h使細(xì)胞貼壁。2~3 h后補(bǔ)充1 mL成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)液正常培養(yǎng)。每隔2~3天換液一次。按照以上換液頻率誘導(dǎo)21~28天，并注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2. 染色鑒定

2.1 細(xì)胞固定

吸去培養(yǎng)基使用適量1xPBS清洗一次,棄去.后取適量4%中性甲醛溶液覆蓋培養(yǎng)器皿底面，室溫固定30~60min后，棄去固定液再使用1xPBS清洗兩次。

2.2 阿利辛藍(lán)染色

向清洗干凈的誘導(dǎo)孔內(nèi)加入適量染色液，避光靜置染色30min。吸去阿利辛藍(lán)染色液，用1xPBS清洗兩次,并加入適量1xPBS避免細(xì)胞干燥。

2.3 誘導(dǎo)評(píng)估

顯微鏡下觀察成軟骨染色效果，并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評(píng)估。誘導(dǎo)成功時(shí)，軟骨組織中的內(nèi)酸性粘多糖可被阿利辛藍(lán)染成藍(lán)綠色。

成軟骨誘導(dǎo)分化操作(三維誘導(dǎo))

1. 干細(xì)胞的準(zhǔn)備

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化下來計(jì)數(shù)，取3x 10^5個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，250g離心4 min。棄上清,加入0.5 mL成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基預(yù)混液，重懸細(xì)胞，150g 離心5min。小心棄去.上清，加入0.5 mL成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo).液，重懸細(xì)胞，150 g離心5 min。將15 mL離心管的管蓋稍稍旋開，放置于37°C，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)。

2. 細(xì)胞分化誘導(dǎo)

24h后觀察細(xì)胞沉淀形變團(tuán)聚的情況，如有明顯的變化，則小心輕柔地?fù)軇?dòng)管底，嘗試讓細(xì)胞團(tuán)脫離管底，全部浸潤(rùn)在誘導(dǎo)液中。

置于37°C, 5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約21天，通常每2天更換一次新鮮配制的成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)液。注意觀察細(xì)胞團(tuán)成球情況及表面光滑度，決定終止細(xì)胞誘導(dǎo)的時(shí)間，并進(jìn)行染色鑒定。

3. 染色鑒定

3.1 軟骨球固定

將軟骨球從離心管中轉(zhuǎn)移至EP管,并使用1xPBS清洗兩次，最后置于適量的4%中性甲醛溶液中。

3.2 石蠟包埋切片

軟骨球經(jīng)石蠟包埋后切片。

3.3 阿利辛藍(lán)染色

將石蠟切片脫蠟和脫水，使用阿利辛藍(lán)染色液染色30 min，用自來水沖洗2 min,蒸餾水沖洗1次。

3.4 誘導(dǎo)評(píng)估

顯微鏡下觀察成軟骨染色效果，并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評(píng)估。誘導(dǎo)成功時(shí)，軟骨組織中的內(nèi)酸性粘多糖可被阿利辛藍(lán)染成藍(lán)綠色。

NOTE:干細(xì)胞的成軟骨分化水平因細(xì)胞類型、細(xì)胞供體來源，培養(yǎng)條件、細(xì)胞代次、細(xì)胞狀態(tài)和分化時(shí)間等因素而異

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化

1.1 明膠包被培養(yǎng)器皿

干細(xì)胞培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間后，可能會(huì)出現(xiàn)脫壁卷邊或漂浮現(xiàn)象，建議使用0.1%明膠溶液對(duì)培養(yǎng)器皿進(jìn)行包被。準(zhǔn)備合適的培養(yǎng)器皿，取適量明膠覆蓋底面37°C靜置30 min,吸取晾干即可使用。

1.2 接種干細(xì)胞

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照2.0x 10e4cells/cm2的細(xì)胞密度接種至包被后的培養(yǎng)器皿中,于37°C，5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至匯合度60~70%，棄掉上清，加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞分化誘導(dǎo)

于37°C, 5% CO2培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)約14~21天，每2~3天換液一次，并注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。根據(jù)細(xì)胞鈣鹽結(jié)晶析出和鈣質(zhì)結(jié)節(jié)形成的情況,決定終止細(xì)胞誘導(dǎo)的時(shí)間，并進(jìn)行染色鑒定。

2. 染色鑒定

2.1 細(xì)胞固定

吸去培養(yǎng)基使用適量1xPBS清洗一次，棄去后取適量4%中性甲醛溶液覆蓋培養(yǎng)器皿底面，室溫固定30~ 60 min,棄去固定液再使用1xPBS清洗兩次。

2.2 茜素紅染色

加入適量茜素紅染色液染3~5 min,吸走茜素紅染色液，用1xPBS清洗兩次，并加入適量1xPBS避免細(xì)胞干燥。

2.3 誘導(dǎo)評(píng)估

顯微鏡下觀察成骨染色效果，并進(jìn)行圖像采集和誘導(dǎo)評(píng)估。誘導(dǎo)成功時(shí)，鈣質(zhì)結(jié)節(jié)與茜素紅染料結(jié)合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。

NOTE:干細(xì)胞的成骨分化水平因細(xì)胞類型、細(xì)胞供體來源，培養(yǎng)條件、細(xì)胞代次、細(xì)胞狀態(tài)和分化時(shí)間等因素而異。