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極性改性反相色譜柱的基本原理和日常使用注意事項

來源:北京迪科馬科技有限公司(迪馬科技)   2022年06月06日 14:40  
   極性改性反相色譜柱是指利用非極性的反相介質(zhì)為固定相,極性有機溶劑的水溶液為流動相,根據(jù)溶質(zhì)極性的差別進行溶質(zhì)分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣,RPC中溶質(zhì)也通過疏水性相互作用分配于固定相表面,但是,RPC固定相表面被非極性基團所覆蓋,表現(xiàn)出強烈的疏水性。因此,需用極性有機溶劑或其水溶液進行溶質(zhì)的洗脫分離。
 
  溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性,一般疏水性越大,分配系數(shù)越大。當固定相一定時,可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)。RPC主要應用于相對分子質(zhì)量低于5000,特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化,也可以用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。由于反相介質(zhì)表面為強烈疏水性,并且流動相為低極性的有機溶劑,生物活性大分子在RPC分離過程中容易變性失活,所以,以回收生物活性蛋白質(zhì)為目的時,應注意選用適宜的反相介質(zhì)。
 
  反相介質(zhì)的商品種類繁多,其中代表性的是以硅膠為載體,通過表面鍵合非極性分子層制備。通過控制反應時間和溫度,可獲得性能穩(wěn)定的反相介質(zhì)。在硅膠基質(zhì)的反相填料中,以鍵合有C18、C8、C2的球形多孔填料較為常見,用途較廣。
 
  RPC固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團,基于樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分離。在生物大分子分離中,多采用離子強度較低的酸性水溶液,添加一定量乙腈、異丙醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作為流動相。
 
  極性改性反相色譜柱的日常使用注意事項:
  1、如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相,應在實驗完畢柱子沖洗干凈,并保存于甲醇或乙腈中。
 
  2、氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時要注意,柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑,以避免腐蝕。
 
  3、若流動相是緩沖鹽并且鹽的濃度比較高分析完畢樣品不要停泵,要立即沖洗色譜柱或者低流速平衡,以免色譜柱前段柱篩板堵塞。
 
  4、使用預柱保護分析柱(硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度)。
 
  5、避免流動相組成及極性的劇烈變化。
 
  6、流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理。

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