2×GoldStar Best MasterMix（無(wú)染料）說(shuō)明書

貨號(hào)：K0656

保存條件：-20℃長(zhǎng)期保存，如需頻繁使用，可存放于2-8℃，盡量避免反復(fù)凍融。

組分說(shuō)明

               Cat. No.                         K0656      K0656B

               Kit Size                         1 ml       5×1 ml

               2×GoldStar Best MasterMix        1 ml       5×1 ml

               RNase-Free Water                 1 ml         5 ml

           注意：2×GoldStar Best MasterMix含有GoldStar  Best DNAPolymerase,

                2×GoldStar Best PCR  Buffer, 3 mM MgCl2和400 µM  dNTPs。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

　　本品為由GoldStar Best  DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑組成的預(yù)混體系，濃度為 2×，具有操作簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、特異性2+強(qiáng)、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，可最大限度地減少人為誤差和污染。該產(chǎn)品所含的      GoldStarBest DNA Polymerase是經(jīng)過(guò)特殊處理的熱啟動(dòng)高保真聚合酶。該聚合酶具有5′-3′DNA聚合酶活性，5′-3′核酸外切酶活性和  3′-5′核酸外切酶活性，在普通PCR條件下，與GoldStar Taq DNA Polymerase相比，具有擴(kuò)增效率高、錯(cuò)配率低的優(yōu)良性能?；瘜W(xué)修飾使該酶在常溫下沒(méi)有聚合酶活性，有效避免在常溫條件下由引物和模板非特異性結(jié)合或引物二聚體而產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增，酶的激活須在 95℃下孵育10分鐘，該條件可以整合入已有的PCR熱循環(huán)程序。優(yōu)化的緩沖體系使酶的作用發(fā)揮最大功效，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段的高保真、高特異性、高擴(kuò)增效率、高靈敏度擴(kuò)增。本品不含染料，PCR程序結(jié)束后可根據(jù)需要加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳操作。擴(kuò)增得到的 PCR產(chǎn)物3′端附有一個(gè)“A”堿基，因此可直接用于 T/A克隆。適用于常規(guī)的 PCR反應(yīng)和對(duì)高保真性有要求的基因克隆等實(shí)驗(yàn)。

質(zhì)量控制

　　經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)外源核酸酶活性； PCR方法檢測(cè)無(wú)宿主殘余DNA；能有效地?cái)U(kuò)增多種基

因組中的單拷貝基因；2-8℃存放三個(gè)月，活性無(wú)明顯改變。

                本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途

    使用方法

    以下舉例為常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的

    片段大小不同進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。

    1. PCR反應(yīng)體系

              試劑                             50 μl反應(yīng)體系           終濃度

              2×GoldStar Best MasterMix          25 μl             1×

              Forward Primer，10 µM                2 μl           0.4 μM

              Reverse Primer，10 µM                2 μl           0.4 μM

              Template DNA                       <1 μg        <1 μg/reaction

              RNase-Free Water                 up to 50 μl

       注意：引物濃度請(qǐng)以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

    2. PCR反應(yīng)條件

步驟                 溫度              時(shí)間

預(yù)變性                95℃            10 min

變性                 94℃             30 s

退火               55-65℃            30 s     30-40個(gè)循環(huán)

延伸                 72℃             60 s

終延伸               72℃             5 min

       注意：1）一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，無(wú)法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí)，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。

       2）延伸時(shí)間應(yīng)根據(jù)所擴(kuò)增片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品中所包含的GoldStar Best DNA Polymerase的擴(kuò)增效率為1 kb/min。

       3）可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

       4）本產(chǎn)品須在預(yù)變性95℃，10 min條件下實(shí)現(xiàn)酶的活化。

    3.結(jié)果檢測(cè)：本產(chǎn)品不含染料，反應(yīng)結(jié)束后，取5 µl反應(yīng)產(chǎn)物加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

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