做過HPLC的朋友都知道一句話：用流動相溶解樣品（等度洗脫），或者是用初始流動相比例溶解樣品（梯度洗脫）。為什么要這么做呢？

我們先來看一個列子：當用100%的乙腈來溶解樣品上機時，峰1出現(xiàn)分叉、展寬，峰2未分叉。當換成用流動相來溶解樣品時，峰1和峰2的峰形都不分叉，峰形較好。是什么原因導致這種現(xiàn)象發(fā)生的呢？那就是溶解效應造成的。

溶劑效應：就是指樣品溶液的溶劑強度強于流動相溶劑強度時可能會造成的峰展寬、峰分叉現(xiàn)象。通常表現(xiàn)為色譜圖上較早洗脫的峰前沿或者開叉，與此同時較晚洗脫的峰則較為正常的現(xiàn)象。例如樣品溶液的溶劑是100%乙腈（100%的強溶劑），而流動相的組成則較弱，20%的乙腈與80%的水。第一個峰是開叉的，并且與第二個峰相比，明顯地變寬了。當樣品溶液的溶劑變成流動相時，所有的峰形都改善了，且變得尖銳。

當溶解樣品的溶劑不同于流動相時，樣品溶劑與流動相發(fā)生混合，樣品溶劑被大量的流動相稀釋。如果樣品溶劑的強度高于流動相，部分樣品在瞬間會表現(xiàn)為在較強溶劑中，并以較快速度通過色譜柱。表現(xiàn)在色譜圖上就是∶色譜峰的保留時間縮短。另一部分樣品被流動相稀釋，在色譜柱上進行充分的保留和洗脫過程，致使這些分子與溶解在強溶劑中的分子通過色譜柱的速度發(fā)生變化，使峰形扭曲，發(fā)生變形。洗脫較早的色譜峰峰變形要比洗脫晚的色譜峰嚴重。

那么如何判斷分叉的峰是否由溶劑效應造成的呢？

第一種方法就是通過HPLC儀器比對一下兩個劈叉峰的紫外吸收波譜，看看他們是否能*一樣的UV特征吸收；第二種方法就是將進樣體積調(diào)小（0.2μL），觀察峰是否好轉。如果滿足以上兩個條件，基本可以肯定是溶劑效應造成的。

產(chǎn)生原因1，樣品溶液的溶劑很可能強于流動相。例如樣品溶液的溶劑是100％乙腈（100％的強溶劑），而流動相的組成則較弱，20％的乙腈與80％的水。

產(chǎn)生原因2，就是進樣量比較大。

產(chǎn)生原因3，樣品的pH值與HPLC流動相pH懸殊。比如酸性流動相體系，樣品pH偏堿性（pH=9）,這種情況下也很有可能發(fā)生其實上面三個原因歸結起來就是一個原因，那就是樣品的溶劑與流動相存在一些不一樣，當樣品進入流動相的時候，由于這種巨大的差異，一部分樣品溶解進入了流動相，一部分還留在進樣的溶劑里面，所以在HPLC上出現(xiàn)了保留的差異，所以要解決這個問題的最佳方案就是，使用流動相的起始梯度溶解樣品。

特別要說明的一點，如果用強于流動相的溶劑來溶解樣品，進樣量較小時，也不一定會出現(xiàn)溶劑效應現(xiàn)象。這是因為進樣量較小，進樣時樣品溶液瞬間被大量的流動相所稀釋，被稀釋的樣品在柱子上有很好的保留和洗脫過程。

如果由于溶解度的問題，不得不改用其余的溶劑，那就只能降低進樣體積來解決，比如 5μl，1μL。