一、GPCR簡介
GPCR（ Guanosine-binding Protein Coupled Receptor）中文名稱為G蛋白偶聯(lián)受體，是一種膜蛋白受體。GPCR作為細(xì)胞信號傳導(dǎo)中的重要蛋白，其共同點(diǎn)是其蛋白體結(jié)構(gòu)中都有七個跨膜結(jié)構(gòu)。研究顯示GPCR參與了很多細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，當(dāng)膜外的配體作用于該受體時，該受體的膜內(nèi)部分與G蛋白發(fā)生結(jié)合，從而激活G蛋白。G蛋白可通過兩種途徑傳遞細(xì)胞外的信息：第一種方式是打開跨膜離子通道，讓外界的離子進(jìn)入；第二種方式是激活第二信使，如：cAMp、IP3/DAG等。簡單來講，GPCR能結(jié)合細(xì)胞周圍環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)并激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號通路，引起細(xì)胞狀態(tài)和功能的改變，同時參與多種生命活動以及內(nèi)分泌與代謝等多種生理過程。從疾病方面來看，GPCR也與糖尿病、心臟病、腫瘤、免疫疾病等重要疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)。

隨著科研和生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的不斷深入，GPCR的重要性也愈發(fā)顯現(xiàn)，為了表彰在這一領(lǐng)域的貢獻(xiàn)，2012年諾貝爾化學(xué)獎授予了兩位美國科學(xué)家：羅伯特·萊夫科維茨（Robert J. Lefkowitz）和布萊恩·科比爾卡（Brian K. Kobilka），他們因“G蛋白偶聯(lián)受體”研究領(lǐng)域的杰出貢獻(xiàn)而獲獎。從生物醫(yī)療領(lǐng)域的數(shù)據(jù)來看，大約40%的現(xiàn)代藥物都以GPCR作為靶點(diǎn)。而至少有三分之一的小分子藥物是GPCR的激活劑或者拮抗劑，在暢銷藥物排行中就有眾多藥物屬于GPCR相關(guān)藥物，比如：充血性心力衰竭藥物Coreg、高血壓藥物Cozaar、乳腺癌藥物Zoladex等，而還有更多這樣的候選藥物小分子在臨床研發(fā)中。

針對GPCR的分類，主流有兩種方法：一是A-F分類系統(tǒng)，面向所有生物體內(nèi)的GPCR蛋白；第二種是將GPCR蛋白被分為Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2這5類。按照第二種分類標(biāo)準(zhǔn)來看，Rhodopsin受體類是GPCR家族中大的一類，而其下還分為多種亞家族。而整個Rhodopsin家族包含各種重要受體，如組胺受體、多巴胺受體、內(nèi)皮素受體、催產(chǎn)素受體等。而其它類GPCR也包含眾多受體種類，如鈣敏感受體、甜味味覺受體等。

二、GPRC單抗藥物開發(fā)
現(xiàn)階段，作為開發(fā)藥物靶點(diǎn)的受體約370個，分布于Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2 五大家族內(nèi)。這些GPCR主要與生理代謝和疾病的形成有關(guān)，包括癌癥、炎癥、感染、代謝疾病等。藥物作用于GPCR靶點(diǎn)，其主要的作用是阻斷或激活胞外信號對靶點(diǎn)的激活，調(diào)控由靶點(diǎn)介導(dǎo)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)以及阻斷病毒通過靶點(diǎn)侵入。作用于GPCR受體的藥物可以是小分子藥物或抗體類藥物，相對于小分子藥物，單克隆抗體藥物治療GPCR相關(guān)疾病擁有多方面優(yōu)勢?？贵w在體內(nèi)的清除率更低，作用時間更長；并且在給定劑量下，抗體的血漿濃度的個體差異更小。另一方面在藥物開發(fā)方面，對于一些受體，小分子藥物通過高通量篩選階段的陽性率很低，成藥難度大。此外單抗藥物可以具有對受體更高的特異性以及避免一些小分子要會帶來的副作用，如小分子藥物可以穿過血腦屏障引起藥副作用。現(xiàn)針對GPCR受體，用于治療癌癥、炎癥和感染的很多抗體藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床或上市，而更多的其它抗體藥物正在加緊研發(fā)的過程中。

三、GPCR靶點(diǎn)的抗體藥物研發(fā)中需要解決的抗體制備相關(guān)問題
現(xiàn)GPCR抗原主要形式有： GPCR全長蛋白、合成的GPCR胞外N端或loop區(qū)域、帶有膜蛋白的細(xì)胞膜碎片、過表達(dá)GPCR的細(xì)胞、帶有GPCR的脂質(zhì)體、帶有GPCR的類病毒顆粒等。各種方法各有特點(diǎn)，現(xiàn)就其存在的問題做一個簡單描述。

圖1.GPCR抗原主要形式（來源：參考文獻(xiàn)3）

全長GPCR作為抗原的優(yōu)勢在于比較純凈且相對接近天然構(gòu)象，但困難在于獲得了全長蛋白后其原包裹在細(xì)胞膜內(nèi)的疏水域也暴露在外，這樣容易篩到結(jié)合跨膜區(qū)的抗體。同時由于疏水域暴露在外，蛋白也容易發(fā)生聚集影響正確抗體的形成。對于合成胞外N端或loop區(qū)制作抗原的方法相對簡單，但它們可能無法模擬蛋白的全部天然構(gòu)象，表位容易遺漏和失真。帶有膜蛋白的細(xì)胞膜碎片和過表達(dá)GPCR的細(xì)胞由于目標(biāo)GPCR在整個膜上含量比例很低，因此會給篩選帶來很高的背景從而影響結(jié)果。脂質(zhì)體和類病毒顆粒作為GPCR蛋白的載體可以有效降低篩選背景，是現(xiàn)在效果較好的方法之一，但由于脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致在在應(yīng)用時有無法忽視的局限。

篩選方法分為體內(nèi)免疫和展示篩選。其中體內(nèi)免疫法是常用和經(jīng)典的方法之一，通過用抗原免疫動物，然后從動物的脾臟中分離B細(xì)胞，制備雜交瘤，篩選單克隆抗體。而是否能更好的得到產(chǎn)生目標(biāo)抗體的B細(xì)胞，用與引起免疫反應(yīng)的抗原的穩(wěn)定性、單一性、期望產(chǎn)生抗體結(jié)合的位點(diǎn)是否外露、不期望產(chǎn)生抗體結(jié)合的部分是否被包裹都顯得尤為重要。

四、Nanodisc用于GPCR抗體的制備
Nanodiscs是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子構(gòu)成的磷脂雙分子層類膜結(jié)構(gòu)。通過這種特殊的結(jié)構(gòu)，GPCR可以整合到Nanodiscs中，保持其生物學(xué)活性，為GPCG的研究提供了有力的技術(shù)支持。膜支架蛋白(MSPs)是載脂蛋白(apo) A-I的縮減版，它們包繞著脂質(zhì)雙分子層從而形成圓盤狀的結(jié)構(gòu)，即納米盤。其包含一個朝向內(nèi)部脂層的疏水面和朝外的親水面。這一結(jié)構(gòu)使得Nanodiscs在水溶液中具有很高的溶解度，同時具有非常高的穩(wěn)定性。通過Nanodisc包裹，純化后的GPCG在保持空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和活性的同時，也將不期望暴露的跨膜域如同在細(xì)胞膜內(nèi)一樣包埋在磷脂雙分子層內(nèi)部。

圖2：膜蛋白組裝到Nanodiscs的原理圖。綠色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白(來源Cube Biotech)

五、Nanodisc包裹純化后的GPCR用于抗原制備有眾多優(yōu)勢
1、Nanodisc可以為GPCR提供一個類似細(xì)胞膜雙分子層的結(jié)構(gòu)，使其原有的結(jié)構(gòu)和功能可以被保護(hù)。同時跨膜區(qū)域和膜外區(qū)域也能和在細(xì)胞膜上一致，避免了直接使用純GPCR作為抗體會產(chǎn)生的結(jié)合跨膜區(qū)域的抗體形成的問題。同時，通過Nanodisc包裹的GPCR作為抗原也避免的直接使用細(xì)胞膜碎片作為抗體會引起高背景等問題，使后續(xù)篩選難度大大降低。

2、Nanodisc 包裹完整GPCR，不會有使用合成胞外N端或loop區(qū)制作抗原造成的表位容易遺漏和失真的問題。

3、Nanodisc通過膜支架蛋白固定磷脂，使其結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，從而避免了使用脂質(zhì)體包裹GPCR作為抗原的不穩(wěn)定和易破裂等問題。

4、為了針對不同的應(yīng)用要求，膜支架蛋白可以是人源化或鼠源化的，如此可以避免用鼠作為免疫動物，人源化的膜支架蛋白會引起不必要的免疫反應(yīng)。

六、將膜蛋白組裝到Nanodiscs中的兩種方法

方法1：組裝溶解在去污劑中的膜蛋白
在去污劑存在條件下將GPCR純化，然后再添加MSPs和磷脂。含有膜蛋白的Nanodiscs能夠自發(fā)地組裝，在去除掉表面活性劑后可以通過凝膠過濾（排阻層析）等方式來純化。

方法2：Nanodiscs與無細(xì)胞表達(dá)體系相結(jié)合
另一個方法是，GPCR在無細(xì)胞表達(dá)體系中被表達(dá)，通過加入已經(jīng)和GPCR結(jié)合預(yù)先組裝的Nanodiscs，膜蛋白能通過無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出來。

圖3：膜蛋白與Nanodisc的兩種組裝機(jī)制(圖片來源Cube Biotech網(wǎng)站)

左圖：膜蛋白（橙色）溶解在去污劑（深灰色）中并與凍干的MSP（綠色）和磷脂（淺灰）混合。然后去除去污劑，形成蛋白-Nanodisc復(fù)合物。右圖：預(yù)組裝了MSP與磷脂的Nanodiscs加入到無細(xì)胞反應(yīng)液（cell-free expression systems）中，新生的GPCR能夠自發(fā)地組裝到Nanodiscs中。

GPCR作為藥物靶點(diǎn)在未來有著巨大的潛力，隨著單克隆抗體研發(fā)相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品的豐富，在可見的未來將會有越來越多針對各類疾病的優(yōu)秀藥物產(chǎn)品推向市場！

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