鹽析法——多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化

在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出,這種方法稱為鹽析.常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等.各種蛋白質(zhì)鹽析時所需的鹽濃度及pH不同,故可用于對混和蛋白質(zhì)組分的分離.例如用半飽和的硫酸銨來沉淀出血清中的球蛋白,飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出來,鹽析沉淀的蛋白質(zhì),經(jīng)透析除鹽,仍保證蛋白質(zhì)的活性.調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH至等電點后,再用鹽析法則蛋白質(zhì)沉淀的效果更好.鹽析法分為兩類,第一類叫Ks分段鹽析法,在一定PH和溫度下通過改變離子強度實現(xiàn),用于早期的粗提液；第二種叫b分段鹽析法,在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現(xiàn),用于后期進一步分離純化和結晶.影響鹽析的因素包括：蛋白質(zhì)濃度、離子強度和類型、PH值、溫度等.針對溫度這一條,需要強調(diào)：在低離子強度或純水中,蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加.但在高濃度下,蛋白質(zhì)、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降.在一般情況下,蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求,可在室溫下進行,只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行.

使用硫酸銨沉淀蛋白需要注意：硫酸銨中常含有少量的重金屬離子,對蛋白質(zhì)巰基有敏感作用,使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液,通入H2S飽和,放置過夜,用濾紙除去重金屬離子,濃縮結晶,100℃烘干后使用.另外,高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性(PH=5.0左右),使用前也需要用氨/水或硫酸調(diào)節(jié)至所需PH.

2.有機溶劑沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化；

有機溶劑的沉淀機理是降低水的介電常數(shù),導致具有表面水層的生物大分子脫水,相互聚集,最后析出.該法優(yōu)點在于：

1)分辨能力比鹽析法高,即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；

2)沉淀不用脫鹽,過濾較為容易；

3)在生化制備中應用比鹽析法廣泛.但是,在常溫下,有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性.例如酒精消毒滅菌就是如此.因此,操作要求在低溫下進行.有機溶劑的選擇首先是能和水混溶,使用較多的有機溶劑是乙醇、甲醇、丙酮,還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、yi腈和2-甲基-2,4戊二醇等.

3.等電點沉淀法——此法單獨應用較少,多與其它方法結合使用；

兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時溶解度最/低,不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點,以此為基礎可進行分離.如工業(yè)上生產(chǎn)胰島素時