2×GC-rich PCR  MasterMix（無(wú)染料）說(shuō)明書(shū)

貨號(hào)：K0658

保存條件：-20℃長(zhǎng)期保存。如需頻繁使用，可存放于2-8℃，盡量避免反復(fù)凍融。

組分說(shuō)明

              Cat. No.                                  K0658

              Kit Size                                    1 ml

              2×GC-rich PCR MasterMix（無(wú)染料）          1 ml

              RNase-Free Water                            1 ml

              注意：2×GC-rich PCR MasterMix含有Es Taq DNA Polymerase,

              2×Es Taq PCR Buffer, 3 mM MgCl2和400  µM dNTP mix。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

　　本品是由Es Taq  DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑

和增強(qiáng)劑組成的預(yù)混體系，濃度為 2×。預(yù)配好的PCR混合液使操作更加2+ 簡(jiǎn)單快捷，可最大限度地減少人為誤差和污染。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的緩沖液配方使酶的作用發(fā)揮最大功效，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜模板的高保真、高效率擴(kuò)增，d創(chuàng)的MasterMix配方使整個(gè)反應(yīng)體系非常穩(wěn)定，重復(fù)性好。本品不含染料， PCR程序結(jié)束后可根據(jù)需要加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳操作。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物3′端附有一個(gè)“A”堿基，因此可直接用于T/A克隆。主要適用于對(duì)保真性要求較高的PCR反應(yīng)和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的模板如GC含量高，有二級(jí)結(jié)構(gòu)等的擴(kuò)增，對(duì)簡(jiǎn)單模板有效擴(kuò)增的片段可達(dá)20 kb，對(duì)復(fù)雜模板可達(dá)10 kb。

質(zhì)量控制

　　經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)外源核酸酶活性； PCR方法檢測(cè)無(wú)宿主殘余DNA；能有效地?cái)U(kuò)增多種基

因組中的單拷貝基因；2-8℃存放三個(gè)月，活性無(wú)明顯改變。

                本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途

    使用方法

    以下舉例為常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的

    片段大小不同進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。

    1. PCR反應(yīng)體系

試劑                          50 μl反應(yīng)體系        終濃度

2×GC-rich PCR MasterMix         25 μl                1×

Forward Primer，10 µM            2 μl               0.4 μM

Reverse Primer，10 µM            2 μl                        0.4 μM

Template DNA                    2  μl              <1 μg/reaction

RNase-Free Water               up to 50 μl

       注意：引物濃度請(qǐng)以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

2. PCR反應(yīng)條件

步驟                 溫度              時(shí)間

預(yù)變性               94℃             2 min

變性                 94℃             30 s

退火                55-65℃           30 s     25-35個(gè)循環(huán)

延伸                 72℃             30 s

終延伸               72℃             2 min

       注意：1）一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，無(wú)法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí)，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。

       2）延伸時(shí)間應(yīng)根據(jù)所擴(kuò)增片段大小設(shè)定，Es Taq DNA Polymerase的擴(kuò)增效率為1 kb/30 s。

       3）可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

    3.結(jié)果檢測(cè)：本產(chǎn)品不含染料，反應(yīng)結(jié)束后取5  µl反應(yīng)產(chǎn)物加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳檢測(cè)結(jié)果。

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