Western Blot實(shí)驗(yàn)試劑的準(zhǔn)備工作
1. 30%儲(chǔ)備膠溶液: 丙烯酰胺(Acr) 29.0g
亞甲雙丙烯酰胺(Bis) 1.0g
混勻后ddH2O,37℃溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室溫。
2. 4×分離膠緩沖液(1mol/L Tris-HCl PH 8.8) Tris 18.17g加ddH2O溶解,濃鹽酸調(diào)PH 8.8,定容至100ml。
3. 4×濃縮膠緩沖液(0.5mol/L Tris-HCl PH 6. 8) Tris 12.1g加ddH2O溶解,濃鹽酸調(diào)PH 6. 8,定容至100ml。
4. 10%SDS:電泳級(jí)SDS 10.0g加ddH2O,68℃助溶,濃鹽酸調(diào)PH 7.2,定容至100ml。
5. 5×電泳緩沖液(PH 8.3): Tris 15.2g
甘氨酸 94g
ddH2O 定容到1000ml
SDS 5g
先在974ml蒸餾水中加入Tris堿,待溶解*后,再加甘氨酸,最后加SDS。
6. 10%過(guò)硫酸銨(AP):0.1g AP加ddH2O至1.0ml,4℃保存,要在一周內(nèi)使用,最好新鮮配制。
7. 2×加樣緩沖液:2×SDS加樣緩沖液
0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2ml
10%SDS 4 ml
β-巰基乙醇 1ml
甘油 2ml
1%溴芬藍(lán) 1ml
置4℃避光保存
8. TEMED:注意室溫較低時(shí)TEMED量可加倍,最后灌膠之前再用
9. 轉(zhuǎn)膜緩沖液(Towbin transfer Buffer): 即1×SDS-PAGE
10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) : NaCl 8.5g
(12H2O)Na2HPO4 2.9011g
(2H2O)NH2PO4 0.24g
加ddH2O定容至 1000ml
11. 封閉液: 1×PBS中加入 30ml
5%(V/V)脫脂奶粉 1.5g
0.02%疊氮鈉 0.006g
0.05%Tween-20 0.015g
12. 漂洗液(PBST):含0.05% Tween-20的PBS溶液
每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-20
13. 水飽和正丁醇: 正丁醇 50 ml
ddH2O 5 ml 加入瓶中震蕩,使結(jié)合,存于室溫。
用時(shí)取上面一相加在凝膠上面。
14. 考馬斯亮藍(lán)染色法試劑:一般用G250考馬斯亮藍(lán)(蛋白定量專用)
染色液: 90 ml甲醇:水(1:1,V/V)和10 ml冰乙酸的混合液中溶解G250馬斯亮藍(lán)0.25g,用Whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾染液以去除顆粒狀物質(zhì)。(染色液多次回收利用)
脫色液:90 ml甲醇:水(1:1,V/V)和10 ml冰乙酸的混合液
15. 麗春紅S染色色法試劑:2%乙酸,
0.5%麗春紅的水溶液
脫色液:TBS
16. Aprotinin:為一58氨基堿性多肽,經(jīng)反復(fù)凍融后,會(huì)發(fā)生集聚,儲(chǔ)存液應(yīng)分裝成小份,保存于-20度,每一小份用后應(yīng)予廢棄。
17. PMSF:在溶液中不穩(wěn)定,應(yīng)在臨用前從儲(chǔ)存液中現(xiàn)加于裂解液中。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF,應(yīng)立即用大量的水沖洗。凡被PMSF污染的衣物應(yīng)予丟棄。PMSF通常配成10mmol/L濃度儲(chǔ)液(1.74或17.4mg/ml溶于異丙醇中)保存于-20度。
18. 顯色液:聯(lián)苯胺顯色液(DAB)
DAB 2ml
10%H2O2 60μl
PBS(0.1mol/L PH6.4) 10ml
19. 三去污裂解緩沖液
0.5mol/L Tris-HCl(PH 8.0) 0.785g/100ml
0.15mol/L NaCl 0.8775 g/100ml
0.02%疊氮鈉 0.02 g/100ml
0.1%SDS 0.1 g/100ml
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