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核酸雜交(Nucleicacid hybridization)，又稱核酸分子雜交。
威尼德分子雜交儀原理：是核酸變性和復性理論。雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開形成單鏈，當理化因素消除后，具一定同源性的兩條(探針和待測核苷酸序列)單鏈在適宜的溫度及離子強度條件下，可按堿基互補配對原則特異性地復性形成雙鏈。核酸分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進行。
分類：核酸分子雜交按作用環(huán)境不同分為固相核酸分子雜交和液相核酸分子雜交。
一、固相核酸分子雜交
原理：將參加反應的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，另一條游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。固相雜交時，未雜交的游離片段很容易漂洗除去，膜上的雜交物容易檢測并能防止靶DNA自我復性，故該方法最為常用。 常用類型：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Sou thern blot雜交、Northern blot雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。
基本操作步驟：
1、制備樣品：從待檢測組織樣品中提取DNA或RNA。DNA應先用限制性內(nèi)切酶消化以產(chǎn)生特定長度的片段，然后通過凝膠電泳將消化產(chǎn)物按分子大小進行分離。再將含有DNA片段的凝膠進行變性處理后，直接轉印到支持膜上并使其牢固結合。這樣檢測片段在凝膠上的位置就直接反映在了轉印膜上。RNA樣品則可直接在變性條件下電泳分離，然后轉印并交聯(lián)固定。
2、制備探針：探針是指一段能和待檢測核酸分子依堿基配對原則而結合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。探針需要被標記上可直接檢測的元素或分子。這樣，通過檢測與轉印膜上的核酸分子結合的探針分子，就可知道被檢測的核酸片段在膜上的位置，也就是在電泳凝膠上的位置，也就知道了它的分子大小。
3、雜交：在雜交前先進行預雜交，封閉膜上非特異的DNA結合位點，以降低非特異性雜交。正式雜交時，由于轉印在膜上的核酸分子已經(jīng)是變性的分子，所以核酸雜交過程中只需變性標記好的探針，再讓探針與膜在特定的溫度下反應，然后洗去未結合的探針分子即可。
4、檢測：檢測的方法依標記探針的方法而異。用放射性同位素標記的探針需要放射自顯影來檢測核酸片段在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法標記的探針則需要用相應的免疫組織化學的方法進行檢測。
二、液相核酸分子雜交
液相核酸分子雜交，是一種研究最早且操作復雜的核酸雜交類型，在過去的30年里雖被應用，但總不如固相雜交那樣普遍，主要原因是雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難，誤差也較高。
常用的兩種固相核酸分子雜交技術
1 .Southern Blot
原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。
用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點突變、擴增重排等。
2. Northern Blot
原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進行轉膜和用探針進行雜交檢測。
用途：檢測樣品中是否含有基因的轉錄產(chǎn)物(mRNA)及其含量。
相關產(chǎn)品
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