主要用途

組織CAMKII激酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過多肽底物受到CAMKII磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)，即采用光度法測定其氧化后吸光峰值的變化，以分析組織裂解樣品中CAMKII活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或*純化酶樣品中CAMKII激酶的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）   60毫升

裂解液（Reagent B）   10毫升

緩沖液（Reagent C）    4毫升

酶促液（Reagent D）  500微升

反應(yīng)液（Reagent E）  500微升

底物液（Reagent F）  500微升

陰性液（Reagent G）  500微升

產(chǎn)品說明書       1份 

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

CAMKII激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 待測樣品準(zhǔn)備

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重500毫克組織重量 

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗

4． （選擇步驟）抽去清理液

5． 移入到一個(gè)液氮凍存管

6． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜

7． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

8． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管

9． 加入置于冰槽里的100至500微升裂解液（Reagent B）（注意：可以調(diào)節(jié)蛋白濃度）

10． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻

11． 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/span>）

12． 即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g

13． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管

14． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

15． 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如組織裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

一、 背景對(duì)照測

1． 移取130微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升酶促液（Reagent D）

3． 加入20微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入20微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入10微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對(duì)照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

二、 樣品測定

1． 移取130微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升酶促液（Reagent D）

3． 加入20微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入20微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入10微升待測樣品（注意：50微克組織裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

五、 計(jì)算樣品活性

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NADH/分鐘

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為25次操作，包括背景操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

6． 建議使用比色皿測定

7． 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測定

8． 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)30分鐘

9． 光度測定后，比色皿須清洗*

10． 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

11． 樣本測定讀數(shù)持續(xù)上升，表明酶活過低或樣品量過低

12． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

13． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

14． 可以使用CAMKII抑制劑（KN-93；IC50=370納摩爾）作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照

15． Ca²⁺/鈣調(diào)素依賴型蛋白激酶II活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位

16． 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感