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影響電泳結果(泳動度)的五大原因

來源:上海遠慕生物科技有限公司   2022年07月27日 11:33  

 

 在使用電泳儀做實驗的時候,可能實驗的結果會受到影響。不同的帶電顆粒在同一電場中泳動的速度不同。常用泳動度(或遷移率)來表示。泳動度是指帶電顆粒在單位電場強度下泳的速度。

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遠慕生物搜集整理了幾種影響泳動度的主要因素:

1、 首先決定于帶顆粒的性質(zhì),即顆粒所帶凈電荷的數(shù)量,大小及形狀。一般說來,顆粒帶凈電荷多,直徑小而接近于球形,則在電場中泳動速度快,反之則慢。泳動度還與分子的形狀,介質(zhì)粘度,顆粒所帶電荷有關,泳動度與顆表面電荷成正比,與介質(zhì)粘度及顆粒半徑反比。帶電荷的高分子在電解質(zhì)溶液中把一些帶有相反電荷的離子吸引在其周圍,形成一離子擴散層。加以電場時,顆粒向符號相反的電極移動即帶陽電荷顆粒移向負極,帶陰電荷顆粒移向正移;離子擴散層由于帶有過剩的與顆粒符號相反的電荷,可以向相反方向移動。結果顆粒與離子擴散之間的靜電引力使顆粒的泳動度減慢,另外,高分了顆粒表面有一層水,在電場影響下,它與顆粒一起移動,可以認為是顆粒的一部分。

2、 電場強度電場強度也稱電位梯度,是指單位長度(每一厘米)支持物體上的電位降,它對泳動度起著十分重要的作用。例如紙電泳。測量25厘米長紙條兩端電壓為250伏特,則電場強度為250伏特/25厘米=10伏特/厘米。一般,電場強度越高,帶電顆粒移動速度越快。根據(jù)電場強度大小,可將電泳分為常壓電泳和高壓電泳,前者的電壓在100-500伏特,電場強度一般是2-10伏特/厘米;后者電壓可高達500-1000伏特,電場強度在200-2000伏特/厘米。常壓電泳分離時間需數(shù)小時至數(shù)天,高壓電泳時間短,有時僅幾分鐘即可,高壓電泳主要用于分離氨基酸,肽,核苷酸,由于電壓升高,電壓也隨之增大,故需冷卻裝置。

3、 溶液的pH值溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度,也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少,對于蛋白質(zhì),氨基酸等兩性電解質(zhì)而言,溶液pH值離電點越遠,顆粒所帶凈電荷越多;電泳速度越快;反之則越慢。例如血清中幾種主要蛋白質(zhì)的等電點各不相同,白蛋白等電點是4.0。α2球蛋白等電點是5.06,β球蛋白等電點是5.1,γ球蛋白等電點是7.1。當在pH8.6的電泳緩沖液中電泳時,這些蛋白質(zhì)都帶負電荷,它們的泳動速度是白蛋白< α2球蛋白>β球蛋白>γ球蛋白。因此,當要分離一種蛋白質(zhì)混合物時,應選擇一種能擴大各種蛋白質(zhì)所帶電荷量差異的pH值,以利于各種蛋白質(zhì)分子的解離。同時,為保持電泳過程中溶液pH恒定也須使用緩沖液。

4、 溶液的離子強度溶液的離子強度是另一個重要選擇的條件,在保持足夠緩沖能力前提下,離子強度要最小。溶液的離子強度越高,帶電顆粒泳動速度越慢,反之越快。通常緩沖液離子強度選擇在之間。濃度大的緩沖液在合適電壓下,有較低的電阻和較大的電流,產(chǎn)熱較高。如果這種額外的熱可以驅(qū)散,高濃度的緩沖液擴散常數(shù)較低,可以產(chǎn)生較窄細的電泳區(qū)帶。離子強度很高時要用低電壓,避免過多產(chǎn)熱,這樣又導致長的電泳時間,以致增加變性和區(qū)帶分離困難。

5、 電滲作用在支持物的電泳中,影響電泳的另一個重要因素是電滲作用。所謂電滲就是指在電場中液體對固體支持物的相對移動,例如在pH8.6時,血清蛋白質(zhì)進行紙電泳時, γ球蛋白與其他蛋白質(zhì)一樣帶負電荷,應該向正極移動,然而它卻向負極方向移動,這就是電滲作用的結果。濾紙的纖維間具有大量孔隙帶有負電荷,如一束毛細管,進行電泳時蛋白質(zhì)通過這些孔隙向前移動。紙的孔隙帶有負電荷,與帶電顆粒一樣可以吸引正離子,因此介質(zhì)沿管壁相對地帶的較多的正電荷。在電場中,帶負電荷的蛋白質(zhì)向正極移動,而介質(zhì)卻向反向陰極移動,從而對蛋白質(zhì)顆粒的泳動起阻礙作用。由于γ球蛋白分子顆粒大,凈電荷較少,移動速度慢,電滲作用大于顆粒向前泳動的力,結果γ球蛋白向后退。而其他血清蛋白質(zhì),因分子較小,凈電荷較多,電滲作用小于分子向前移動的力,因此分子向前移。所以,血清蛋白質(zhì)電泳后球蛋白反而在點樣位置之后。

 

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