如何在質(zhì)粒中添加/克隆GST標(biāo)簽

將GST標(biāo)簽添加到目標(biāo)蛋白的優(yōu)先方法是使用pGEX系列載體，它們有不同的蛋白質(zhì)裂解位點(diǎn)，而這對(duì)于后續(xù)提到的去除GST標(biāo)記方法尤其重要。圖4描述了我們推薦克隆方法的過程和步驟。

（1）pGEX載體都有一個(gè)包含多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)（MSC），這些位點(diǎn)因pGEX載體而異。如表2所述。此外，所有的pGEX載體均含有三個(gè)終止密碼子，覆蓋了MSC之后DNA菌株上所有的三個(gè)可能的閱讀框，以確保所表達(dá)的蛋白質(zhì)本身并不包含終止密碼子。

圖4：在目標(biāo)蛋白質(zhì)上添加GST標(biāo)簽的克隆過程概述

（2）下一步是得到一個(gè)目的基因/蛋白質(zhì)的PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)方向上均帶有所選pGEX載體MCS中存在的限制性酶切位點(diǎn)。這些引物應(yīng)滿足以下條件：1.  3-4 nts的懸臂（越長越有利于限制性酶切反應(yīng)，建議3-4個(gè)）

2.  限制性位點(diǎn)

3.  20-25 nts的目標(biāo)基因

以在eGFP上添加一個(gè)GST標(biāo)簽為例

圖例 – 上游引物懸臂

限制性位點(diǎn) -> 以BamHI為例

eGFP的前20 nts5'-GGG GGATCC ATGAAACATCACCATCACCA-3'

圖例 –下游引物懸臂

限制性位點(diǎn) -> 以EcoRI為例，反向互補(bǔ)

eGFP的最后20 nts，反向互補(bǔ)

5'-GGG GGATTC TTTGTATAGTTCATCCATGC-3'

注意本文僅是介紹如何將GST標(biāo)簽添加目的蛋白質(zhì)上，其他方法如酵母或細(xì)菌的同源重組也可完成。

        表2: 不同的pGEX載體和其MCS內(nèi)的限制性酶切位點(diǎn)從5'到3'端排序

GST標(biāo)簽蛋白的純化是如何進(jìn)行的？

GST標(biāo)簽蛋白純化是一種親和層析法，它利用GST對(duì)還原谷胱甘肽（其天然底物）的高親和力，依據(jù)所優(yōu)選的純化方法將谷胱甘肽與瓊脂糖凝膠或磁珠結(jié)合而達(dá)到純化的目的。如圖5為GST-標(biāo)簽親和微球的示意圖。不同供應(yīng)商的GST標(biāo)簽親和產(chǎn)品的實(shí)際純化方案是不同的，包括僅針對(duì)其自身特定的GST親和力珠進(jìn)行優(yōu)化的不同緩沖液成分間的差異。因此，建議不要將一個(gè)供應(yīng)商的GST標(biāo)簽蛋白純化方案應(yīng)用于其他供應(yīng)商產(chǎn)品。

圖5：GST-標(biāo)簽親和微球的示意圖。通過微球表面的柔性間隔物將谷胱甘肽三肽與微球相結(jié)合，也可用于與GST標(biāo)簽蛋白的結(jié)合。

GST標(biāo)記的蛋白質(zhì)純化方案

圖6介紹了用GST親和磁珠進(jìn)行蛋白質(zhì)純化的過程，但這些核心步驟僅基于使用GST-標(biāo)簽親和磁珠進(jìn)行純化。

步驟1：加入細(xì)胞裂解液后細(xì)胞裂解，細(xì)胞的整個(gè)蛋白質(zhì)組懸浮在裂解緩沖液內(nèi)，但帶有GST標(biāo)簽的蛋白未與其它蛋白質(zhì)分離。

步驟2：在細(xì)胞裂解液中加入GST親和標(biāo)簽的磁珠，加入的磁珠量應(yīng)多于細(xì)胞裂解液中帶GST標(biāo)簽?zāi)繕?biāo)蛋白的數(shù)量。

步驟3：旋轉(zhuǎn)管/燒瓶幾個(gè)小時(shí)，使谷胱甘肽磁珠與細(xì)胞裂解液內(nèi)的所有GST標(biāo)簽蛋白充分結(jié)合。

步驟4：由于GST標(biāo)簽蛋白與谷胱甘肽磁珠的結(jié)合特異性，所以僅帶有GST標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白會(huì)與磁珠結(jié)合，而不會(huì)與其它蛋白質(zhì)結(jié)合。

步驟5：對(duì)細(xì)胞裂解液施加磁力，使GST標(biāo)簽蛋白與谷胱甘肽珠結(jié)合，而不會(huì)含有其它蛋白質(zhì)。

步驟6：去除未結(jié)合的細(xì)胞裂解液/蛋白質(zhì)上清， 帶有GST標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白現(xiàn)已被純化。

圖6：使用磁珠純化帶有GST標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白的示例性工作流程概述。

為了驗(yàn)證帶有GST標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白是否純化成功，建議利用Western Blot（蛋白質(zhì)印跡法）通過抗GST抗體檢測(cè)純化蛋白。蛋白質(zhì)印跡法示例可在此查看。

如何去除GST標(biāo)簽？

GST標(biāo)簽有26千道爾頓（kDa），是目前最大的親和標(biāo)簽之一。作為一個(gè)完整的蛋白質(zhì)，它甚至?xí)笥谒Y(jié)合的一些蛋白質(zhì)，因此，科研者就會(huì)擔(dān)憂，這種大小的蛋白質(zhì)人工連接在另一個(gè)蛋白質(zhì)上是否會(huì)干擾蛋白質(zhì)的功能性。所以是否有可能在蛋白質(zhì)純化后去除GST標(biāo)簽，以確保它不會(huì)以任何方式阻礙純化了的蛋白質(zhì)后續(xù)研究。pGEX載體系列的創(chuàng)建者已經(jīng)考慮到了這個(gè)問題，所以在表2中也已經(jīng)提到。按照“如何在質(zhì)粒中添加/克隆GST標(biāo)簽 ”一章中描述的方式創(chuàng)建GST標(biāo)簽融合蛋白后可以選擇在其后去除此GST標(biāo)簽。在質(zhì)粒的MCS的5'端添加一個(gè)特定的蛋白裂解位點(diǎn)，即使在純化后，N-末端的GST-標(biāo)記也可以被裂解，這也可以作為純化過程中的一種洗脫方法，而不僅僅是在瓊脂糖樹脂和磁珠純化方案中提到的洗脫緩沖液。由于這種方法可能會(huì)有小概率使目標(biāo)蛋白質(zhì)包含對(duì)應(yīng)的蛋白酶切位點(diǎn)，所以在pGEX載體中有三種不同的蛋白裂解位點(diǎn)可供選擇。

           表3：不同的pGEX載體及其包括的蛋白酶裂解位點(diǎn)。

GST標(biāo)簽去除方案（示例）

注意：該方案描述了如何使用凝血酶裂解位點(diǎn)從自由洗脫的GST融合蛋白上裂解GST標(biāo)簽。

                     表4：凝血酶裂解所需的試劑

步驟（常規(guī)情況）

1. 在洗脫液或純化柱中加入10個(gè)凝血酶裂解單位~10µl每毫克的GST融合蛋白

2. 輕輕混勻，將混合物在室溫（22℃）下孵育2-16小時(shí)。

3. 孵育后，加入1mM的PMSF或ABESF終止反應(yīng)。

4. 通過SDS檢查結(jié)果。

5. 通過SDS色譜法直接分離裂解產(chǎn)物（如：排組層析法）。

如果已經(jīng)找到了理想的裂解條件，則可以用線性的方式擴(kuò)增程序。

提示：可培養(yǎng)足量的GST標(biāo)簽蛋白，并可在SDS-Page凝膠上觀察到0.01至0.06單位和不同孵育時(shí)間（例如2h，4h，6h等）的凝血酶。按所述方法停止反應(yīng)，并將試劑分裝，放置在-20℃保存。

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