低分子肝素（low-molecular-weight heparin，LMWH） 是近年發(fā)展起來的新一代肝素類抗血栓藥物，其抗血栓作用優(yōu)于肝素，而抗凝血作用低于肝素，且具有皮下注射吸收良好、生物利用度高、體內半衰期長、出血傾向小等優(yōu)點，目前已廣泛應用于臨床。

根據LMWH的來源、生產工藝、末端結構的不同，LMWH 分為許多不同的種類，如達替肝素鈉、依諾肝素鈉、那曲肝素鈣、帕米肝素鈉、汀肝素鈉等。達替肝素鈉（Dalteparin Sodium）是低分子肝素的一種，由亞硝酸降解肝素得到，重均分子量5600～6400，峰位分子量6000，硫酸化程度為2.0～2.5/雙糖單位。

本次以達替肝素鈉為例，使用高效離子交換色譜法測定游離硫酸根含量。

樣品前處理

精密稱取達替肝素鈉20 mg，加水溶解并稀釋至10 mL，過0.22 µm濾膜。

色譜條件：

分析柱：IonPac AS11，250×4mm；

保護柱：IonPac AG11，50×4mm；

柱溫：30℃；

淋洗液：3. 0 mmol/L 碳酸鈉溶液；

流速：1.50 mL/min；

定量環(huán)：25 µL

抑制器：ASRS300 4 mm，自循環(huán)模式，電流為23 mA

檢測方式：抑制型電導

結果和討論

樣品濃度的選擇

達替肝素鈉為多糖，在實驗條件下保留在色譜柱上，不能被洗脫。樣品濃度為2 mg/mL時，連續(xù)進樣10次，硫酸根保留時間可提前0.3 min。為提高實驗的穩(wěn)定性，延長色譜柱使用時間，可在滿足定量限的前提下，適當降低達替肝素鈉的濃度。

色譜柱的選擇及淋洗液梯度條件優(yōu)化

樣品中盡含有氯離子和硫酸根離子，非常易于分離。本實驗選用IonPac AS11色譜柱、3.0 mmol/L碳酸鈉溶液作為淋洗液，操作簡單。、

重現性、線性和靈敏度

取達替肝素鈉樣品，平行處理六份，在選定的色譜條件下進行分離分析，硫酸根的重現性較好，峰面積、保留時間、峰高的相對標準偏差（RSD）均低于5%。選擇一個樣品重復六次進樣，硫酸根的保留時間、峰面積和峰高的相對標準偏差（RSD）均低于5%，其結果見下圖。

達替肝素鈉樣品中硫酸根的重現性結果

在選定色譜條件下配制適宜濃度范圍的離子標準曲線，硫酸根在0.1~40 mg/L范圍內具有良好的線性關系，其線性相關系數r=0.9995。在本實驗條件下，基線噪音約為1.0 nS，根據三倍基線噪音計算出方法對硫酸根的定量限為31.7 µg/L，折合樣品中硫酸根含量0.00015%。

實際樣品分析及加標回收

取達替肝素鈉樣品測定并進行加標實驗，硫酸根的加標回收率依次在99~102%之間。樣品檢測結果見下圖。

實際樣品檢測結果及其加標回收率

采用本方法可以方便、快捷、準確檢測達替肝素鈉中的硫酸鹽，操作較為簡單，方法重現性較好，結果可靠。本實驗所使用的色譜柱同時可用于肝素鈉其它檢測項目如多硫酸軟骨素等項目的檢測。

肝素鈉中多硫酸軟骨素的鑒別及測定

色譜條件：

色譜柱AS11離子分析柱250*2mm

AG11離子保護柱50*2mm

淋洗液A：0.04%NaH2PO4， pH3.0

淋洗液B：0.04%NaH2PO4/14%NaCIO4，pH3.0

流速：0.22mL/min

進樣體積：10uL

二元梯度：

實際樣品測定譜圖

肝素鈉產品中多硫酸軟骨素的測定（參照中國藥典2010及美國藥典方法）

樣品前處理：取樣品，制成20mg/mL的水溶液。

肝素鈉粗產品中多硫酸軟骨素的測定

樣品前處理：

取樣品0.1g,加水2.5mL,混勻溶解后加2.5mL乙腈，混勻后，于冰箱中沉降10min，取出后用10000rpm高速離心機離心10min，取上層清液4ml，用氮氣吹干后，用水定容至8ml，定容后的液體過0.22um尼龍濾膜，之后過OnGuard RP 柱，濾液上機分析。

Labbuy實驗室商城精選的AS11色譜柱同時還可以用于肝素鈉及肝素鈉注射液中硫酸根、多硫酸軟骨素、葡萄糖胺及半乳糖胺等多項目的檢測。實驗快速，效果靈敏度高、選擇性好。

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