前言：色譜柱是HPLC系統(tǒng)的心臟。色譜柱的技術(shù)從HPLC流行以來(lái)有了很大的進(jìn)步，分離速度和性能有了提高，同時(shí)穩(wěn)定性和重現(xiàn)性也提高很明顯。下面以反相色譜柱為例，介紹一些色譜柱基本知識(shí)。

一、色譜柱填料

下圖為色譜柱的組成

1、色譜柱載體

大多數(shù)用于HPLC分離的柱填料使用硅膠微粒作為擔(dān)體，也有基于多孔聚合物擔(dān)體的色譜柱。

下圖所示為HPLC中常見(jiàn)的幾種微粒類型：

全多孔微球因其粒徑、孔徑和表面積變化較大，一般情況下效能、荷載量、耐久性等都較好，為我們常用。

硅膠填充微粒

硅膠微粒是我們常用的，優(yōu)點(diǎn)是它們的機(jī)械強(qiáng)度高，可保證填充床長(zhǎng)時(shí)間在很高的操作壓力下工作，柱效保持穩(wěn)定。在用于制作HPLC填料的材料中，硅膠基質(zhì)色譜柱的柱效*高。

另一個(gè)優(yōu)勢(shì)就是他們可以和不同的配合基鍵合（C8、C18、苯基和氰基等）。

用于HPLC的硅膠表層都是羥基化的，稱為水合硅膠（-SiOH），水合硅膠分為三種存在類型，如下圖：

含有自由硅羥基的硅膠因?yàn)橹挥胁糠至u基化，酸性很強(qiáng)，能與堿性溶質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的無(wú)益結(jié)合，因此，含自由、酸性硅羥基濃度高的硅膠基質(zhì)會(huì)使堿性樣品保留值增加，峰變寬、拖尾。見(jiàn)下圖。

有些色譜柱經(jīng)過(guò)封端后能夠降低自由硅羥基，減少對(duì)堿性樣品的影響。見(jiàn)下圖2.色譜柱固定相

2.1.鍵合固定相

硅膠基質(zhì)的反相填料一般通過(guò)在擔(dān)體表面上共價(jià)鍵合有機(jī)硅烷或沉積聚合物有機(jī)涂層。 

2.2、鍵合固定相的形式：許多鍵合相填料都是用單官能團(tuán)試劑制得，也有些商品填料是用三官能團(tuán)(有時(shí)也用雙官能團(tuán))硅烷與硅膠表面反應(yīng)形成的交聯(lián)聚合表層。見(jiàn)下圖。

3、鍵合的類型

圖所示為填料與官能團(tuán)共價(jià)鍵合的各種類型。圖a所示為用雙或三官能團(tuán)硅烷反應(yīng)的輕度縱向交聯(lián)相，由這些反應(yīng)得到的鍵合相，在低pH時(shí)，比單體相的非交聯(lián)固定相更穩(wěn)定，但與用單官能鍵合相比較，用此方式制得的填料柱間的保留值與選擇性不太穩(wěn)定。圖b所示為另一類型的鍵合硅烷的表面，稱作橫向交聯(lián)，這些填料在低pH與高pH環(huán)境中均非常穩(wěn)定。如圖c和d所示，是非交聯(lián)型的柱填料，通常通過(guò)單官能團(tuán)二甲基氯硅烷與表面硅經(jīng)基反應(yīng)得到，存在二甲基取代及位阻保護(hù)結(jié)構(gòu)兩種，如：正一十八烷基硅烷ODS或C₁₈鍵合相材料，單官能團(tuán)硅烷反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)是重現(xiàn)性好，一個(gè)硅烷基與一個(gè)硅烷分子反應(yīng)，產(chǎn)生可預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)，而且制得的填料柱效較高，因?yàn)槿苜|(zhì)分子在薄固定相層內(nèi)的擴(kuò)散迅速。

一般情況下，由于鍵合相配位體的空間位阻效應(yīng)，硅膠基質(zhì)表面的硅羥基不能*參加反應(yīng)，隨著鏈長(zhǎng)或硅烷體積的增大，參加反應(yīng)的硅經(jīng)基比例相應(yīng)減小，這些未反應(yīng)的硅羥基能在分離離子樣品，特別是堿性樣品的時(shí)候通過(guò)離子交換作用導(dǎo)致保留值增加，譜峰拖尾，柱間重復(fù)性差。

二、色譜柱各個(gè)參數(shù)意義

孔徑是粒徑是硅膠球的直徑，孔徑是指硅膠球上小孔的直徑。但這個(gè)小孔是不穿過(guò)球體的，只是球上凹進(jìn)去的一塊?？梢院?jiǎn)單想成高爾夫球的樣子。樣品分子進(jìn)入這個(gè)小孔，在小孔內(nèi)被鍵合的烷基吸附，然后出來(lái)有快有慢，達(dá)到分離的目的。

孔徑小，含孔率高，則比表面積大，載碳量高„ 化合物在孔內(nèi)分離„ 孔徑大小必須和分子大小相匹配，分子必須能進(jìn)入孔內(nèi)，一般小分子使用80-120A， 大分子通常使用300A。為了達(dá)到最佳分離,一般要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上。