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反相色譜是迄今在高效液相色譜中應用較廣泛的技術，主要是因為它適用于分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物質(zhì)，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來分離的，含有疏水的機制也能以同樣的保留方式分離。
反相色譜柱利用各種流動相和添加物可以有很多的應用，一些技術利用添加物可以改變或修飾填料的表面，有時候這些添加物有可能會污染鍵合相表面。
硅膠表面因為有著疏水鍵合相而有一些別的化學性質(zhì)，殘留的硅烷醇存在于所有的硅膠鍵合填料中，這些硅烷醇具有弱酸性，因此能與某些待分析物合基質(zhì)成分，特別是堿性成分。因為硅烷醇的pKa值大約是4.5，離子化能在中性pH條件下發(fā)生因此與陽離子產(chǎn)生靜電相互作用就有可能發(fā)生。較老的A型硅膠能容納高濃度金屬離子（有時候100ppm或更多），而這能使硅膠表面的酸性更大甚至能發(fā)生金屬鰲合現(xiàn)象或清除一些化合物。殘留硅烷醇在非末端封閉的硅膠合短鏈鍵合相如C2或C4上更讓人煩惱。
反相色譜柱使用者必須清楚他們所用的固定相表面特殊性質(zhì)和可能的分析物－固定相表面的相互作用，這樣當他們使用反相方法時才能考慮到可能的基質(zhì)相互作用。例如，非常疏水的樣品基質(zhì)如玉米油，高芳香物質(zhì)，和蠟能粘住固定相裝填表面并且改變他們的性質(zhì)。含有蛋白質(zhì)物質(zhì)的生物流體也能吸附在裝填表面。盡管分析者想盡最大努力來保護HPLC柱子，某些分析物－基質(zhì)污染能使固定相受到有害的影響。
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