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進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)要進(jìn)行哪些步驟
常用的計(jì)數(shù)方法主要有手工計(jì)數(shù)(如利用改良牛鮑計(jì)數(shù)板)和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)(經(jīng)費(fèi)充裕組常備)。從原理來(lái)說(shuō)，這兩種方法基本類似，大致是通過(guò)臺(tái)盼蘭或者熒光染料染色后，用肉眼或者用攝像機(jī)拍照后進(jìn)行計(jì)數(shù)，差別就是前者人累，且精準(zhǔn)度和穩(wěn)定性較差；后者不累人，且精準(zhǔn)度和穩(wěn)定性較好。
單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)的第一步是單細(xì)胞懸液的制備，而懸液制備中細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性直接影響單細(xì)胞測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量。
1. 計(jì)數(shù)板
用96%酒精沖洗計(jì)數(shù)板后，用干凈鹿皮擦凈，另擦凈蓋片一張；把蓋片覆在計(jì)數(shù)板上面，使之微微移向一側(cè)，露出計(jì)數(shù)板臺(tái)面少許，以便滴加細(xì)胞懸液；
2. 染色
取吸管1 支，伸入培養(yǎng)瓶中，輕輕反復(fù)吹打細(xì)胞懸液使細(xì)胞重懸均勻后，立即吸細(xì)胞懸液少許，向另一離心管中滴入細(xì)胞懸液9 滴，再滴入臺(tái)盼藍(lán)染液1 滴，混勻，置2~3 分種；
3. 加懸液
把計(jì)數(shù)板平放在顯微鏡臺(tái)上，立即從計(jì)數(shù)板邊緣輕輕滴1~2 滴已染色的細(xì)胞懸液，使之充滿計(jì)數(shù)板和蓋片間空隙中；
4. 鏡檢
鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞分散各處，健康細(xì)胞胞體完整，透明不著色，凡著色細(xì)胞均為不健康者。計(jì)算四角大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)；壓中線者只計(jì)算左線和上線者，右線和下線不計(jì)算在內(nèi)(即僅計(jì)算壓兩個(gè)邊的細(xì)胞)。
5. 接種培養(yǎng)
通過(guò)計(jì)數(shù)測(cè)知懸液中細(xì)胞數(shù)后，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞數(shù)量向培養(yǎng)容器中接種。細(xì)胞接種數(shù)量隨實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、血清含量和?xì)胞生物性狀而定；一般接種量在1~10x105細(xì)胞/毫升范圍，實(shí)驗(yàn)周期短，希望細(xì)胞增殖較快時(shí)，接種量可大些。用含血清量大的培養(yǎng)液培養(yǎng)胚胎來(lái)源細(xì)胞、無(wú)限細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系時(shí)，細(xì)胞接種數(shù)量不宜太大。
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