原代細胞的體外培養(yǎng)過程中，其生長時往往會混有多種不同類型的細胞。比如來自皮膚組織的細胞進行培養(yǎng)時可以出現(xiàn)表皮細胞與纖維下?lián)芡瑫r生長的情況。所以原代細胞的分離純化在初期細胞培養(yǎng)時比較關(guān)鍵。
 

原代細胞的純化方法主要有以下幾種：

一、自然純化法：

原代細胞由于具有較強的增殖能力，因此可以采用通過長期多代傳代生物方式單獨培養(yǎng)某一類型的目的細胞，靠自然優(yōu)化的方式進行細胞純化，這種方法的缺陷是無法按實驗需求去自由去自由選擇要培養(yǎng)的細胞。而且培養(yǎng)周期較長，適合應用于腫瘤細胞、成纖維細胞等細胞系建立使用。
 

二、人工純化法：

人工純化的方法在細胞純化方面應用較為廣泛，它是通過人工干預的方式，營造利于目的細胞生長的環(huán)境條件，從而抑制目的外細胞的生長從而達到細胞純化的一種純化方式。目前通用的主要有以下幾種：

酶消化純化法：

根據(jù)上皮細胞與成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受能力是不相同的，所以采用酶消化的方式可以使這兩種細胞有效分開。這種純化方法不僅適用于貼壁細胞，同樣適用于半貼壁細胞和黏附細胞等。
 

操作步驟如下：

1.將0.25%胰蛋白酶分兩次加入25ML的細胞培養(yǎng)瓶中，并輕搖勻。每次加入的量約為1ML左右，當胰蛋白酶覆蓋細胞表面時，緩緩倒出。

2.擰上瓶蓋進行細胞消化，在顯微鏡下觀察到纖維細胞部分脫落時，即可加入培養(yǎng)基停止消化。

3.在培養(yǎng)瓶上標注不同類型的生長區(qū)域。加入培養(yǎng)基繼續(xù)進行多次傳代培養(yǎng)后即可分離。

機械刮分法：

在進行貼壁培養(yǎng)時，不同類型的細胞往往會成片區(qū)狀混雜生長，我們可以使用細胞刮去除非目的細胞區(qū)域，具體操作步驟如下 ：

1.將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，找出不同細胞類型的生長區(qū)域并用硅膠細胞刮劃分非目的細胞使其懸浮于培養(yǎng)基中，操作是需要注意不要傷及目的細胞。

2.加入適量培養(yǎng)基進行沖洗，反而后繼續(xù)加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，如此反復多次即可達到純化分離效果。
 

反復貼壁培養(yǎng)法：

由于成纖維細胞的貼附速度優(yōu)于上皮細胞，一般情況下，10-30分鐘即可完成貼壁過程，而上皮細胞則需較長時間才能完成貼壁生長。利用這一原理分離純化細胞步驟如下：

1.在培養(yǎng)瓶內(nèi)加入適量的培養(yǎng)基，混入細胞懸液常溫下靜置20分鐘。

2.當顯微鏡下觀察細胞開始出現(xiàn)貼壁時，緩緩搖動后，將細胞懸浮液，輕導另一個培養(yǎng)瓶中，重復第一步操作。

3.重復多次后即可實現(xiàn)細胞的純化和分離。

原代細胞的分離和純化對于后續(xù)的傳代培養(yǎng)起著重要的作用，也會直接影響到細胞系的穩(wěn)定性，所以也可以多種方法綜合使用以增加細胞純化力度，盡可能保證原代細胞的可靠一致性。
 

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