動脈粥樣硬化病變的非隨機分布與不同的血流模式和作用于血管壁的血流動力學(xué)有關(guān)。血管內(nèi)皮細胞不斷暴露于不同的流動模式和剪切應(yīng)力，包括低剪切應(yīng)力和振蕩剪切應(yīng)力（OSS）的擾動流和相對高剪切應(yīng)力的脈動流（PSS），導(dǎo)致對血管壁產(chǎn)生不同的影響。PSS 通常具有抗炎和抗動脈粥樣硬化的作用，而 OSS 的擾動流會促進動脈粥樣硬化的形成和進展。

之前的研究表明，ECs 能夠?qū)?OSS 感知為一種機械信號，以誘導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體（BMPR）相關(guān)的 Smad1/5 的力特異性激活，從而導(dǎo)致細胞周期蛋白A 的上調(diào)和 p21 和 p27 的下調(diào)，從而增加 EC 細胞周期進程和增殖。因此，Smads 的力特異性激活可能是一種有前途的基于血流動力學(xué)的分子靶點，可用于干預(yù)與血流紊亂相關(guān)的血管疾病，如動脈粥樣硬化。

據(jù)報道，石榴提取物（PE）通過降低循環(huán)中的低密度脂蛋白水平和巨噬細胞衍生的泡沫細胞的形成來發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。長期補充 PE 通過上調(diào)內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）表達和調(diào)節(jié) ECs 中氧化敏感基因的表達來抑制 OSS 相關(guān)的動脈粥樣硬化。然而，石榴皮多酚（PPP）的提取物及其純化的化合物安石榴甙（punicalagin，PU）是否對OSS誘導(dǎo)的血管功能障礙具有改善作用，從而防止動脈粥樣硬化尚不清楚。

在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系、新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院、國家衛(wèi)生研究院（中國臺灣）、香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院的一項聯(lián)合研究中，證明了 PU 是 PPP 的生物活性抗動脈粥樣硬化成分，并進一步研究了 PPP 和 PU在體外和體內(nèi)OSS 誘導(dǎo)的 EC 功能障礙和炎癥相關(guān) VSMC 病理生理反應(yīng)中的作用。該研究提供了新的信息，表明 PPP 和 PU 作為治療動脈粥樣硬化的新治療成分可能具有很大的潛力。

首先，En face免疫染色顯示，用 750 mg/kg的PPP 處理可使小鼠主動脈中油紅 O-染色斑塊的面積減少 56%，而 250 mg/kg 和 500 mg/kg 的 PPP 使斑塊面積減少 23% 和 37%。這些數(shù)據(jù)表明，PPP在體內(nèi)以劑量依賴性方式發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

主動脈根部病變面積是主動脈瓣狹窄的重要參數(shù)，與動脈粥樣硬化斑塊的嚴重程度相關(guān)。因此，在主動脈根部的橫截面中進一步測量了斑塊面積。結(jié)果表明，在 PPP 處理的低密度脂蛋白受體敲除（LDLR^–/– ）小鼠的病變區(qū)域中，Mac-2 染色的巨噬細胞含量顯著減少，表明 PPP 減輕了斑塊中炎性巨噬細胞的浸潤。

脂質(zhì)代謝紊亂被認為在動脈粥樣硬化的進展中起重要作用。用 750 mg/kg 或 500 mg/kg PPP處理 LDLR^–/– 小鼠顯著降低了血漿甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）的水平。

由于 PU 是 PPP 中的主要生物活性化合物，因此研究了 PU 處理是否對動脈粥樣硬化產(chǎn)生與 PPP 相似的保護作用。結(jié)果表明，PU的效果與 PPP 類似。此外，PU 處理還降低了 HFD 喂養(yǎng)的 LDLR^–/– 小鼠的血漿 TC 和 TG 濃度而不影響體重。這些結(jié)果表明，PU 是 PPP 中主要的活性抗動脈粥樣硬化成分。

PPP 和 PU 發(fā)揮內(nèi)皮依賴性血管保護作用

然后實驗研究了 PPP 和 PU 是否可以通過改善血管功能發(fā)揮超出上述作用的動脈粥樣硬化保護作用。ECs 在正常生理條件下會受到規(guī)則的層流剪切應(yīng)力，通過持續(xù)激活 eNOS 來刺激一氧化氮（NO）的釋放。然而，由于OSS的存在，eNOS活性在擾動剪應(yīng)力處降低。

結(jié)果表明，PPP和PU對PE引起的血管收縮有舒張作用，當主動脈用 eNOS 抑制劑 L-NAME處理或剝離主動脈內(nèi)皮時，這種作用消失，證明PPP和PU的血管舒張作用是內(nèi)皮依賴性的（圖1 A-D）。這些結(jié)果表明，PPP和PU可能通過改善內(nèi)皮功能發(fā)揮動脈粥樣硬化保護作用。

圖1   PPP和PU的內(nèi)皮依賴性血管保護作用。

（A-D）PPP（A）和PU（C）的內(nèi)皮依賴性血管保護作用和定量結(jié)果（B，D）。

PPP 和 PU 抑制體內(nèi)擾動流誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮中 Smad1/5 的激活

之前的研究表明，在狹窄后的部位，當局部血流被OSS（0.5 ± 4 dynes/cm2）干擾時，擾動流可以在狹窄后的部位誘導(dǎo)磷酸化-Smad1/5 的力特異性激活。因此，實驗研究了 PPP 和 PU 是否可以調(diào)節(jié) Smad1/5在體內(nèi)狹窄后位點的這種力特異性激活。使用 U 形夾對大鼠腹主動脈進行收縮（圖2 A），對縮窄的主動脈連續(xù)切片的免疫組織化學(xué)檢查表明，狹窄后的部位在管腔 EC 層中表現(xiàn)出高水平的磷酸化-Smad1/5 。相比之下，在收縮的上游和中間點幾乎沒有可檢測到的磷酸化-Smad1/5 染色（圖2 B）。用 PPP 或 PU 處理顯著降低了由狹窄后位點的流動紊亂引起的磷酸化-Smad1/5 的升高（圖2 C、D）。這些結(jié)果表明，PPP 和 PU 可有效抑制體內(nèi)擾動流誘導(dǎo)的 ECs 中 Smad1/5 的力特異性激活。

圖2   PPP和PU抑制由體內(nèi)擾動流誘導(dǎo)的EC中Smad1 / 5的力特異性激活。

（A）通過使用U型夾部分收縮大鼠腹主動脈，建立了腹主動脈狹窄的大鼠模型。采用免疫熒光染色法檢測磷酸化-Smad1/5/vWF/SMα-肌動蛋白在收縮部位上游、中點和下游區(qū)域的蛋白表達。（B）生理鹽水對照組（C）PPP處理組（D）PU處理組。

PPP 和 PU在體外抑制 OSS 誘導(dǎo)的 ECs 中的 Smad1/5 磷酸化

接下來進一步測試了 PPP 或 PU 對 ECs 中 Smad1/5 激活的影響，以響應(yīng) OSS 的干擾流。將 OSS 應(yīng)用于 ECs 可在 24 h 內(nèi)誘導(dǎo) Smad1/5 的持續(xù)磷酸化。與靜態(tài)對照相比，OSS 迅速（4 h）誘導(dǎo) ECs 中 Smad1/5 的磷酸化，并在 24 h 后保持升高。這種 OSS 誘導(dǎo)的 ECs 中 Smad1/5 的磷酸化在 PPP 或 PU 處理后標準化為基礎(chǔ)水平（圖3 A、B）。

先前的研究表明，OSS 誘導(dǎo)的 ECs 中 Smad1/5 的激活是通過激活 BMPRs 來實現(xiàn)的。因此，用骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）處理 ECs 30 分鐘以激活 BMPR 及其下游 Smads 作為對照實驗，以探索 PPP 和 PU 對 ECs 中 BMP 引發(fā)的信號傳導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，PPP 和 PU 顯著抑制了 BMP 誘導(dǎo)的 ECs 中 Smad1/5 的磷酸化（圖3 C）。

圖3   PPP 和 PU 可抑制由OSS 或 BMP 誘導(dǎo)的 ECs中 Smad1/5 的激活。

（A-C）蛋白質(zhì)印跡分析由OSS誘導(dǎo)的ECs中指示分子的蛋白質(zhì)表達4小時（A）或24小時（B），BMP誘導(dǎo)30分鐘（C）。

PPP 和 PU 抑制 OSS 誘導(dǎo)的 ECs 促炎反應(yīng)

EC炎癥是動脈粥樣硬化發(fā)病的早期事件，OSS通過觸發(fā)TNF-α等信號分子的釋放來激活EC促炎反應(yīng)，從而促進動脈粥樣硬化進展。因此，用 OSS 或 TNF-α處理 ECs 4 h 以刺激 ECs 的促炎狀態(tài)，并檢查 PPP 或 PU 的作用。結(jié)果表明，PPP 和 PU 對 OSS 誘導(dǎo)的 ECs 促炎反應(yīng)具有抑制作用。

PPP 和 PU 抑制 OSS 誘導(dǎo)的 EC 增殖

OSS 誘導(dǎo)的炎癥促進了 ECs 的增殖。在暴露于 OSS 24 h后，數(shù)據(jù)表明，PPP 和 PU 可以抑制 Smad1/5 的力特異性激活，從而減弱由 OSS 干擾流動誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)和 ECs 增殖。

PPP 和 PU 抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 VSMC 遷移、表型調(diào)節(jié)和促炎反應(yīng)

由于 VSMCs 的遷移、增殖和表型調(diào)節(jié)是導(dǎo)致動脈粥樣硬化進展的關(guān)鍵因素，因此使用傷口愈合實驗檢測了 PPP 和 PU 對 TNF-α 誘導(dǎo)的 VSMCs 遷移的影響。結(jié)果表明，PPP和PU抑制了TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs遷移（圖4 A）。為了進一步探索 PU 對 VSMCs 表型調(diào)節(jié)的影響，測定了收縮性 VSMCs 標記物，即 SMα-actin 的基因表達（圖4 B）。結(jié)果表明 SMα-actin 表達被 TNF-α 降低，并且這種作用被 PU 處理逆轉(zhuǎn)。VSMCs 的合成表型可釋放促炎性 IL-6，而 c-fos 可促進 VSMCs 增殖。實驗發(fā)現(xiàn)，PU 抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的 VSMCs 中 IL-6 和 c-fos 的表達（圖4 C）。這些結(jié)果表明，PPP 和 PU 可以保護VSMCs中 TNF-α 誘導(dǎo)的增殖、遷移、炎癥和表型調(diào)節(jié)。所有這些反應(yīng)都參與了動脈粥樣硬化的進展。

圖4   PPP和PU抑制TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs的遷移，表型調(diào)節(jié)和炎癥。

（A）通過傷口愈合試驗檢測VSMCs的遷移。（B）蛋白質(zhì)印跡分析及PU對VSMCs中α-SMA表達的影響的定量結(jié)果。（C）對IL-6和c-fos mRNA表達的實時熒光定量PCR結(jié)果。

總之，該研究證明 PPP 和 PU 通過抑制 OSS 誘導(dǎo)的增殖和炎癥來保護 EC 功能障礙。PPP 和 PU 的這些保護作用可能是由于它們抑制了 ECs 中 Smad1/5 的力特異性激活。此外，目前的結(jié)果表明，PPP 和 PU 可以在促炎刺激下抑制 VSMCs 的炎癥、遷移和表型調(diào)節(jié)。研究結(jié)果為 PPP 和 PU 抑制受干擾流/炎癥誘導(dǎo)的 EC 功能障礙和 VSMC 增殖、遷移和表型調(diào)節(jié)，進而抑制動脈粥樣硬化的機制提供了新的見解。

參考文獻：Anwaier G, Lian G, Ma GZ, Shen WL, Lee CI, Lee PL, Chang ZY, Wang YX, Tian XY, Gao XL, Chiu JJ, Qi R. Punicalagin Attenuates Disturbed Flow-Induced Vascular Dysfunction by Inhibiting Force-Specific Activation of Smad1/5. Front Cell Dev Biol. 2021 Jun 28;9:697539. doi: 10.3389/fcell.2021.697539. PMID: 34262908; PMCID: PMC8273543.

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