Western Blot是生物修煉的一大實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在不做定量Western Blot，都不敢自詡學(xué)霸的了，暗暗擦汗的有沒有？在討論如何從Western Blot中獲得定量數(shù)據(jù)之前，先定義一下我們所說(shuō)的“定量”是什么意思是非常有用的，何為定量，必須符合下列準(zhǔn)則：

使用一個(gè)定義的過程進(jìn)行檢測(cè)，即Western Blot。

這個(gè)過程產(chǎn)生一個(gè)可重復(fù)的結(jié)果，即是精確度。

測(cè)量反映了一個(gè)“真實(shí)”的結(jié)果，即是準(zhǔn)確度。

定量Western Blot除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，是一定要檢測(cè)內(nèi)參的，也就是內(nèi)部參照（Internal Control），目的是校正蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印和上樣過程中導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)，內(nèi)參通常指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用其作為參照物。

在發(fā)表文章時(shí)，Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果需內(nèi)參進(jìn)行校正，但仍有一些科研人員在實(shí)驗(yàn)中忽略內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測(cè)定作為規(guī)范是比較各種樣品間上樣量等同的唯1方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法，都存在局限性，例如BCA方法對(duì)還原性試劑兼容性差，Bradford方法對(duì)去垢劑兼容性差，A280方法影響因素比較多，不能*準(zhǔn)確的確定各種樣品的蛋白濃度。在Western Blot實(shí)驗(yàn)時(shí)使用內(nèi)參，即可簡(jiǎn)便地對(duì)轉(zhuǎn)印和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。

那么如何實(shí)現(xiàn)Western Blot實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參的檢測(cè)呢？簡(jiǎn)單講就是在WB過程中，除加入靶標(biāo)蛋白的抗體外，也加入內(nèi)參蛋白的抗體，同時(shí)實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白的檢測(cè)。通過歸一化，可以校正上樣誤差和轉(zhuǎn)印誤差，從而獲得比較準(zhǔn)確的Western Blot結(jié)果。

使用熒光方法進(jìn)行定量Western Blot檢測(cè)，可進(jìn)行多重檢測(cè)，熒光信號(hào)穩(wěn)定，持久，影響因素少，不用剝離膜和剪膜，實(shí)驗(yàn)條件一致，更容易獲得定量Western Blot的數(shù)據(jù)。Azure600可以同時(shí)進(jìn)行4通道熒光成像，無(wú)需剝離和重孵育，靶標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白同時(shí)在一張印跡膜上成像，更容易被期刊雜志接收。

如果蛋白表達(dá)是高豐度的，可見熒光方法也可以嘗試，如果是3色RGB可見熒光，能夠同時(shí)檢測(cè)兩種靶標(biāo)蛋白和一個(gè)內(nèi)參蛋白。