實(shí)驗(yàn)方法原理

磷酸化位點(diǎn)的確定也使用一些通用方法；磷酸化蛋白質(zhì)被純化，如果可能蛋白質(zhì)要均一；磷蛋白被特異性的化學(xué)或酶反應(yīng)切斷、產(chǎn)生肽混合物，其中含有一到兩個(gè)磷酸肽不同之處在干其分離磷酸肽的策略是為了確定氨基酸序列，定位肽段內(nèi)磷酸化的殘基。上面所述的分離方法， 2D-PP 作圖、 HPLC 或 lMAC 方法，也同樣適宜于微量制備磷酸肽用于確定磷酸化位點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)材料 蛋白樣品

實(shí)驗(yàn)步驟

過(guò)去確定磷酸化位點(diǎn)測(cè)序最/常用的是逐步化學(xué)降解法，如絲氨酸和蘇氨酸磷酸化分析方法、酪氨酸磷酸化分析方法, 最近，此方法已經(jīng)主要被質(zhì)譜方法所取代 。非放射活性和放射活性磷酸肽測(cè)序的方法，這兩種方法可以補(bǔ)充．在某些情況下可以替代質(zhì)譜方法來(lái)確定磷酸化位點(diǎn)。非放射活性方法是用于檢測(cè)磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨胺，包括β-消除，與巰基乙醇反應(yīng)形成s- 乙基化半胱氨酸或β-甲基-s-乙基半胱氨酸，它們很容易以 PTH 衍生物的形式從自動(dòng)測(cè)序儀中提取出來(lái)。放射活性方法是由 Ceerenkov 計(jì)數(shù)檢測(cè)器檢測(cè)在 Edman 化學(xué)降解測(cè)序僻環(huán)中釋放出的放射性活度。

如果測(cè)絲氨酸或蘇氨酸磷酸鹽殘基，磷酸鹽被除去，可觀察到32p-磷酸鹽和各自的 PTH衍生物。在酪氨酸磷酸鹽情況下，磷酸酯鍵更穩(wěn)定，分析的提取物是 PTH 磷酸酪氨酸。如果得到的磷酸肽的量非常有限，也許不可能用化學(xué)降解法測(cè)肽序列，但是在降解循環(huán)后，放射活性從肽中釋放，通常有可能確定肽內(nèi)磷酸化位點(diǎn)。