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白細(xì)胞分離：（加速紅細(xì)胞沉降法）
| 加速紅細(xì)胞沉降法 利用高分子量的聚合物促使紅細(xì)胞凝聚成串錢狀，從而加速紅細(xì)胞沉降，使 | |||||||||
| 之與白細(xì)胞分離。 | |||||||||
| 常用的高分子聚合物有明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及甲基纖維素等。 | |||||||||
| （1） 試劑及配制 | |||||||||
| 3%明膠（灝洋生物產(chǎn)）（粘度為25泊以上）：選取明膠，用生理鹽水配成3%溶液，置沸水 | |||||||||
| 浴加熱溶解，分裝，高壓蒸汽滅 | |||||||||
| 菌8磅15-20min. | |||||||||
| 6%右旋糖酐（灝洋生物產(chǎn)）（分子量200-400KD）：用生理鹽水配制。 | |||||||||
| 操作方法分為2種。 | |||||||||
| *種：①取抗凝靜脈血加入等量3%明膠鹽水溶液中，混勻或用3份血液與1份3%明膠溶液混 | |||||||||
| 勻；②將試管直 | |||||||||
| 立靜置室溫或37℃溫箱中30-60min,利用明膠與紅細(xì)胞的粘合作用，促使紅細(xì)胞快速下沉，而白 | |||||||||
| 細(xì)胞留在明膠溶液 | |||||||||
| 中；③用毛細(xì)吸管吸取富含白細(xì)胞的上層液，移入另一試管中；④按自然沉降法④-⑤操作。 | |||||||||
| 第二種：①取1份右旋糖酐溶液加等量抗凝血，混勻；②按操作方法1的②-④操作。 | |||||||||
| 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離試劑：（聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法） | |||||||||
| 外周血中單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同， | |||||||||
| 紅細(xì)胞和多核 | |||||||||
| 細(xì)胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比重為1.075左右。利用比重1.077左右的分 | |||||||||
| 層液作密度梯度 | |||||||||
| 離心，使一定比重的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。 | |||||||||
| 1．試劑及配制 | |||||||||
| ⑴聚蔗糖泛影葡胺分層液（LTS1077）：（灝洋生物有成品供應(yīng)），比重為1.077±0.001 | |||||||||
| ⑵臺(tái)盼藍(lán)染液：稱取4g臺(tái)盼藍(lán)，于研缽中用少量雙蒸水研磨，加雙蒸水至100ml ,1500r/min離心 | |||||||||
| 15min,吸出上層液， | |||||||||
| 即為4%水溶液。用前，1.8%氯化鈉溶液1倍，即為2%臺(tái)盼藍(lán)染液。 | |||||||||
| 2.操作方法 | |||||||||
| ⑴取靜脈血放入抗凝管，搖允，用Ph7.2-7.6 Hank 液稀釋血液1-2倍。 | |||||||||
| ⑵取LTS1077聚蔗糖-泛影葡胺分層液（灝洋生物產(chǎn)）3-4ml,放入15X150mm試管中。 | |||||||||
| ⑶用毛吸管吸取稀釋血液，在離分層液上1cm處，沿試管壁徐徐加入，使稀釋血液重疊于分層液 | |||||||||
| 上，稀釋血液與 | |||||||||
| 分層液體積比例約為2：1。 | |||||||||
| ⑷用水平離心機(jī)以2000r/min離心30min,離心后管內(nèi)容物分為三層，上層為血漿（內(nèi)含血小板）， | |||||||||
| 中間層為分層液， | |||||||||
| 底層為紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞。在上、中層液體界面處可見到乳白色渾濁的單個(gè)核細(xì)胞層。 | |||||||||
| ⑸用毛細(xì)吸管輕輕插到白膜層，沿試管壁周緣吸取界面層單個(gè)核細(xì)胞，移入另一試管中。 | |||||||||
| ⑹加5倍以上體積不含Ca2+、Mg2+Hank液，混勻，1500r/min離心10min,吸棄上清，重復(fù)洗滌2次。 | |||||||||
| ⑺末次離心后，吸盡上清。按每毫升血液標(biāo)本加0.2ml含20%小牛血清Hank液重新混懸細(xì)胞。取1 | |||||||||
| 滴細(xì)胞懸液置血 | |||||||||
| 6 | |||||||||
| 球計(jì)數(shù)板內(nèi)計(jì)數(shù)。然后細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至2X10 /ml | |||||||||
| ⑻細(xì)胞活力檢測(cè)：取1滴細(xì)胞懸液加1滴2%臺(tái)盼藍(lán)染液混勻，加蓋片，顯微鏡高倍鏡檢?；罴?xì)胞 | |||||||||
| 不著色，折光強(qiáng)； | |||||||||
| 死細(xì)胞被染成藍(lán)色，體積略膨大?；罴?xì)胞數(shù)應(yīng)在95%以上。 | |||||||||
| 3．注意事項(xiàng) | |||||||||
| ⑴用稀釋后的全血可是單個(gè)核細(xì)胞得率高，將稀釋的血液疊加于分層液上時(shí)，一定要細(xì)心，動(dòng)作 | |||||||||
| 要輕，避免沖散 | |||||||||
| 分層液面或與分層液混合而影響分離結(jié)果。 | |||||||||
| ⑵配制單個(gè)核細(xì)胞懸液所用的培養(yǎng)液要求等滲，具緩沖作用，并對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。 | |||||||||
| ⑶吸取單個(gè)核細(xì)胞時(shí)，應(yīng)避免吸出過(guò)多上清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染。 | |||||||||
| ⑷配制好的單個(gè)核細(xì)胞可放室溫或0-4℃，后一條件較好，可減低細(xì)胞代謝活動(dòng)。注意不要迅速 | |||||||||
| 改變其所出的溫 | |||||||||
| 度，以免造成“溫度”休克。 | |||||||||
| 通用型細(xì)胞分離液（LTS1130） 的比重的配方（灝洋生物產(chǎn)） | |||||||||
| 取比重LTS1077的人淋巴細(xì)胞分離液（灝洋生物產(chǎn)） 3ml ,放入15X150mm試管中。 | |||||||||
| 用PBS將肝素抗凝血稀釋1-2倍后，將稀釋全血加到LTS1077分離液上，稀釋的血液：分離液約為 | |||||||||
| 2：1。 | |||||||||
| 用水平離心機(jī)以1500r/min離心10min,離心后，單個(gè)核細(xì)胞位于血漿和分離液的界面層，紅細(xì)胞和 | |||||||||
| 粒細(xì)胞沉淀在 | |||||||||
| 分離液層下，一部分單核細(xì)胞和血小板位于分離液層上。 | |||||||||
| 吸取界面單個(gè)核細(xì)胞層，用PBS洗三次。 | |||||||||
| 用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液重疊單個(gè)核細(xì)胞，配成所需濃度的細(xì)胞。 | |||||||||
| 用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢查細(xì)胞活力。 | |||||||||
| NK細(xì)胞分離試劑：細(xì)胞分離液不連續(xù)梯度分離法 | |||||||||
| 通用型細(xì)胞（LTS1130）分離液，為無(wú)毒、無(wú)刺激的新型密度梯度離心分離劑。其在離 | |||||||||
| 心過(guò)程中會(huì)自然 | |||||||||
| 形成密度梯度，從而將不同密度的細(xì)胞分離出來(lái)。 | |||||||||
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