ELISA檢測是一種免疫檢測方法，通常用于測量生物樣品中的抗體或抗原，包括蛋白質(zhì)或糖蛋白。像其他免疫檢測法一樣，它們依靠抗體與目標的結(jié)合來促進檢測。雖然不同類型的ELISA檢測有差異，但大多數(shù)檢測都有一些應(yīng)該考慮共同的階段。

1、板包被

大多數(shù)ELISA檢測第一步是將檢測的第一個成分與包被板結(jié)合。這通常是通過被動吸附完成的，一個非特異性的過程，所以結(jié)果將取決于涂在包被板上的東西。

如果使用了含有抗原的樣品，那就需要一個具有選擇性的包被板，因為各種抗原都會結(jié)合，而不僅僅是那些感興趣的。然而，如果像用于抗體檢測的ELISA間接法那樣使用純化抗原，或像ELISA夾心法那樣使用捕獲抗體，那么我們已經(jīng)準備了一個具有選擇性的包被板。

包被板的類型大多數(shù)是聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生物，其具有不同的結(jié)合特性，這取決于目標物質(zhì)和檢測的性質(zhì)。一些目標物質(zhì)，包括重度糖基化的蛋白質(zhì)、碳水化合物、DNA、脂類、短肽和有洗滌劑的蛋白質(zhì)，是不能很好吸附的。在這些情況下，建議使用經(jīng)過處理允許共價連接到表面的包被板。

2、孵育

將試劑加入ELISA板后，必須進行孵育，以便有時間進行結(jié)合或反應(yīng)。每次孵育的溫度和時間將取決于檢測步驟和正在進行的操作。通常在樣品應(yīng)用之后，與37℃下孵育1小時。

然而，像阻斷這樣的步驟可以在冰箱中過夜，測定過程中的孵育通常在室溫下進行，時間短得多。

3、洗滌

洗板是在應(yīng)用在檢測每個組成部分之間，直到結(jié)果測定的一個重要步驟。溶液從孔中排空后，通常使用磷酸鹽緩沖鹽水-20（PBST）做為緩沖液清洗孔，以去除任何殘留的未結(jié)合抗原、抗體或試劑。

這可以用多通道移液器手工完成，或使用自動洗板機。

不充分的清洗可能會導(dǎo)致高背景信號，而過多的清洗會導(dǎo)致樣品信號低。不一致的清洗可能會導(dǎo)致整個板塊的不一致，從而導(dǎo)致不可靠的結(jié)果。

4、阻斷

在用蛋白質(zhì)包被ELISA板后，阻斷通常是必要的，以防止在接下來方案步驟中測定抗體的任何非特異性結(jié)合。

與檢測無關(guān)的混合蛋白被添加到板中并進行孵育，占據(jù)任何可用的非特異性結(jié)合位點。常見的蛋白質(zhì)阻斷緩沖液選擇包括脫脂干乳、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白。

另外，非離子洗滌劑，如Tween 20或Triton X-100，可作為阻斷劑使用，但不能像蛋白質(zhì)那樣提供永jiu性阻斷。無效的板塊阻斷會導(dǎo)致背景噪音增加，降低檢測的靈敏度和特異性。

5、抗體

實驗性抗體是大多數(shù)ELISAs的基石，選擇正確的抗體至關(guān)重要，特別是在使用多種抗體的情況下。單克隆抗體和多克隆抗體都可以使用，它們都有各自的有點和缺點。單克隆抗體提供高特異性，但成本較高。另一方面，多克隆抗體可以在多個結(jié)合點與目標結(jié)合，放大信號并提高靈敏度。

使用采用二級抗體的方法增加了額外的步驟，延長了檢測時間，增加了出錯機會，需要更多優(yōu)化來找到合適的兼容抗體對。然而，使用多克隆二級抗體所帶來的靈敏度提高可能使其成為一種值得或必須的有效檢測方法發(fā)展方向。

6、測定

無論使用哪種ELISA類型，最后一步都是測定步驟，最常見的是利用酶介導(dǎo)的可見顏色變化化學反應(yīng)，然后可以用紫外-可見分光光度法測量。

酶結(jié)合抗原或抗體被應(yīng)用到測試孔中，如果目標存在，它就會與之結(jié)合。當酶的適當?shù)孜锉惶砑拥桨话迳蠒r，它會引起顏色變化，與孔內(nèi)結(jié)合的目標物的數(shù)量成正比。辣根過氧化物酶（HRP）是一種常用共軛物，一般與底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）合作使用。底物在HRP的作用下變成藍色，然后在加入硫酸溶液后變成黃色，停止反應(yīng)。

然后可以用酶標儀（在TMB加入終止液后，在450nm波段測定），這是一種紫外可見分光光度計，來確定每個孔的吸光度值，并根據(jù)檢測設(shè)計進行校正和計算，如減去空白孔平均值、技術(shù)重復(fù)平均值或與標準比率計算。