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將熒光基團加入到PCR反應(yīng)體系中，通過不斷累積熒光信號從而使對PCR全程的實時監(jiān)測實現(xiàn)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析未知模板的方法，即是熒光定量PCR技術(shù)。在實時熒光定量PCR中，實時檢測全程PCR擴增過程，按照反應(yīng)時間和熒光信號的變化能夠?qū)⒁粭l曲線繪制成。
定量方法
在實時熒光PCR中，模板的定量包括相對定量和定量2種方法。相對定量是指在一定樣品中靶序列相對于另一參照序列的量的變化。定量通常根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來使我們所感興趣基因的拷貝數(shù)確定。
1.相對定量法
相對定量法又分為比較Ct值的相對定量法和比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量法兩種方法。
?。?）比較Ct值的相對定量法
該方法是同時擴增待測靶基因片段和內(nèi)參照基因片段，擴增反應(yīng)既能夠在兩個反應(yīng)管中也能夠在一個反應(yīng)管中進行，并且通過兩者的ct值的差來測量。在采用此方法過程中，相對量的計算需要用到數(shù)學(xué)公式。靶基因和內(nèi)源控制物的擴增效率大體上相同是該方法的前提。因此應(yīng)用過程中效率的偏移會或多或少影響實際拷貝數(shù)的估計。所以，反應(yīng)體系的優(yōu)化的加強是目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率相等的保障。
?。?）比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量法
相對定量法指的是在一定樣本中，靶序列相對于另一參照樣本量變化情況進行分析的方法，在使用該方法過程中，參照物必須準(zhǔn)備，因此定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制比較容易，只要確定了標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度就能夠進行對比分析。
2.定量
定量是通過已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出未知樣本的量的方法。該方法，需要對標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度情況進行明確，再將標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋。分為幾個不同梯度濃度然后進行反應(yīng)測試?？v坐標(biāo)為測得的Ct值，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值，從而將標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制出來，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線，在對未知樣品定量分析的過程中樣起始拷貝數(shù)能夠通過ct值被推算出來。
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