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不同的實(shí)驗(yàn)中我們都會(huì)遇到封閉液，像常規(guī)的ELISA實(shí)驗(yàn)中封閉液也是不可queshao的，那讓我們來(lái)看看哪些是ELISA實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的吧！
ELISA的試劑盒說(shuō)明上寫(xiě)封閉液用蔗糖溶液，一般是用BSA或酪蛋白的蛋白分子封閉空白位點(diǎn)，蔗糖封閉的原理：
- ELISA實(shí)驗(yàn)中，蔗糖本身沒(méi)有封閉作用;
- 封閉液一般是BSA（牛血清白蛋白）、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠等或者是Tween-20(0.05 - 0.1%)稀溶液PBST或者TBST等。
- 加蔗糖的主要目的是保護(hù)ELISA板子吸附(包被)的蛋白，起到“保護(hù)劑”的作用。
- 蔗糖溶液一般在ELISA板子經(jīng)過(guò)BSA封閉后加，當(dāng)然也有將蔗糖加到封閉液中同時(shí)進(jìn)行處理;那一種更好需要你實(shí)驗(yàn)后來(lái)驗(yàn)證。但多數(shù)選擇前者。
除此外，封閉劑還可用5%的脫脂乳，0.4%的明膠，但是實(shí)驗(yàn)表明前者比較好，后者不容易洗干凈未結(jié)合上的明膠。
- SA是常用的封閉劑，成分單一適用于大多數(shù)情況。若免疫原是偶聯(lián)BSA的， BSA有很強(qiáng)的免疫原性，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生很多的針對(duì)BSA的抗體，為避免交叉反應(yīng)，不能用BSA、脫脂奶粉等封閉，可以選用酪蛋白或無(wú)蛋白的封閉劑封閉。大部分BSA中有少量的抗體殘留，會(huì)導(dǎo)致抗原/抗體之間的交叉反應(yīng)，產(chǎn)生高背景，雜帶較多或使得本底水平增高。
- 封閉血清的原理主要有兩點(diǎn)，一是待檢樣本會(huì)有些與蛋白非特異性結(jié)合的物質(zhì)，從而導(dǎo)致背景過(guò)高，因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結(jié)合，從這點(diǎn)看，BSA和血清沒(méi)有明顯區(qū)別。二是待檢樣本中可能會(huì)有Fc受體，可以和抗體恒定區(qū)結(jié)合，與抗體特異性無(wú)關(guān)，封閉血清中有抗體，因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結(jié)合。BSA則無(wú)法封閉Fc受體。
- 脫脂奶粉的優(yōu)點(diǎn)是價(jià)錢(qián)便宜，但是由于成分相對(duì)復(fù)雜，所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會(huì)導(dǎo)致背景增加，此外，因?yàn)樽陨砗?不能用于標(biāo)記的抗體系統(tǒng)。
- 酪蛋白 和BSA作用類(lèi)似，普通酪蛋白不易溶解。中性和堿性條件下帶有負(fù)電性，與同樣帶負(fù)電荷膠體金之間存在排斥力，而膜一般都是帶正電荷，會(huì)與酪蛋白有一定的吸附作用，用酪蛋白封閉效果好些。無(wú)蛋白化合物 甲醛：與PVDF膜表面的微結(jié)構(gòu)反應(yīng)或者結(jié)合，使之失去結(jié)合蛋白的疏水力或者空間結(jié)構(gòu)域。去污劑(吐溫-20)：Tween-20是一種非離子型去污劑，有復(fù)性抗原的作用，與膜疏水性吸附，有很強(qiáng)的對(duì)非特異性吸附的洗脫作用，同樣可以降低蛋白間的疏水作用，可提高特異性的識(shí)別能力。
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