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人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞均來自新鮮組織，用于培養(yǎng)該細(xì)胞的組織采集是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。
人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法：
一、材料與設(shè)備
1.設(shè)備超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、水浴鍋、CO2培養(yǎng)箱、-10℃冰箱、-20℃冰箱。
2.無菌材料大培養(yǎng)皿、止血鉗、靜脈插管、500ml大燒杯、消毒的蒸餾水、50ml離心管、刻度吸管、彎頭吸管、T25培養(yǎng)瓶、廣口試劑瓶、臍帶(1根)、保鮮液(0.01%EDTA/DMEM,4℃儲(chǔ)藏)、高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青/鏈霉素、D-Hanks溶液、I型膠原酶、VEGF或ECGS。
二、操作流程
1.產(chǎn)科無菌取臍帶1根，置于含保鮮液的廣口試劑瓶中4℃保存(避免污染)，在較短的時(shí)間內(nèi)，將臍帶攜入實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行以下操作。
2.在超凈工作臺(tái)或無菌層流工作臺(tái)上，將臍帶用D-Hank溶液清洗干凈，將靜脈插管插入臍靜脈中，并用絲線結(jié)扎、固定。
3.用20ml注射器將37℃的D-Hanks溶液注入臍靜脈，反復(fù)沖洗至清洗液無色澄清為止。
4.用血管鉗夾住臍靜脈的另一端，并將0.2%的Ⅰ型或Ⅱ型膠原酶(約20ml)通過靜脈插管注入臍靜脈中，至臍靜脈充盈為止(排掉靜脈管中的空氣)。
5.將臍帶放置在盛有37℃水的玻璃燒杯中，在37°C水浴條件下消化約20min(每5min抽吸/注入1次)。
6.當(dāng)酶液變成混濁時(shí)(在顯微鏡下可見大量游離細(xì)胞)，將酶液在臍靜脈中反復(fù)抽吸沖打3次后，吸出并置于50ml離心管中。
7.細(xì)胞懸液經(jīng)350g離心5min后，棄去上清液，并用D-Hanks溶液清洗2次，然后再以350g離心5min。
8.棄去上清液，將細(xì)胞溶于8ml內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(M l99 80ml、FBS 20ml、PS 1ml、L-Gln 2mM、ECGS 10mg/100ml、Heparan 4000U/1 00ml、Insulin mu/100ml)中，接種于預(yù)先包被2%明膠的T25培養(yǎng)瓶中。
9.細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，24h后換液，棄掉未貼壁細(xì)胞。之后每2~3d換液1次，待細(xì)胞匯合時(shí)消化傳代。
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