細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備

無菌操作

提前開啟紫外照射30min消毒滅菌，工作臺開燈通風(fēng)10min，用75%酒精擦拭臺面，并開啟超凈工作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)數(shù)分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。

每次操作只處理一株細(xì)胞株，避免細(xì)胞間交叉污染。

實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺，再次以 75% 酒精擦拭無菌操作臺面。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在中央無菌區(qū)域，一般不要再邊緣區(qū)域操作。

器材耗材備足

在開始細(xì)胞培養(yǎng)之前，先檢查一下移液管和瓶子的數(shù)量是否充足，以免在開始實(shí)驗(yàn)后再次出入操作臺，這樣可以降低細(xì)胞污染的風(fēng)險(xiǎn)。

細(xì)胞培養(yǎng)基也應(yīng)先預(yù)熱，選擇只預(yù)熱部分培養(yǎng)基而非整瓶加熱，不但可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，而且可以避免因反復(fù)加熱培養(yǎng)基而造成的蛋白質(zhì)降解。

結(jié)束操作后，需盡可能避光保存。

細(xì)胞培養(yǎng)的定期檢查

定期檢查培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，即形狀和外觀，對于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)取得成功至關(guān)重要。

a.檢查培養(yǎng)液顏色與透明度的變化，顏色變黃，說明PH值下降；變紅或紫紅色，說明PH值上升，細(xì)胞生長停滯、死亡，一般生長穩(wěn)定的細(xì)胞2-3天換液一次，生長緩慢的細(xì)胞可3-4天換液一次。

b.觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，細(xì)胞長滿瓶底的80-90%，應(yīng)及時(shí)傳代。

c.觀察細(xì)胞形態(tài)變化，細(xì)胞透明度大、折光性強(qiáng)、輪廓清晰為佳。

除確認(rèn)細(xì)胞的健康狀態(tài)外，每次操作細(xì)胞時(shí)通過肉眼和顯微鏡檢查細(xì)胞還可早期發(fā)現(xiàn)污染征象，避免污染擴(kuò)散至實(shí)驗(yàn)室其他細(xì)胞。

注意微生物污染，常常出現(xiàn)培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細(xì)胞菌，不僅僅指微生物，包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物及細(xì)胞。

細(xì)胞變質(zhì)的征象

細(xì)胞變質(zhì)的征象包括核周出現(xiàn)顆粒、細(xì)胞與基質(zhì)解離以及細(xì)胞質(zhì)空泡形成。

這些變質(zhì)征象可能為多種原因所致，例如：培養(yǎng)物污染、細(xì)胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質(zhì)，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基。

變質(zhì)嚴(yán)重時(shí)將會(huì)成為不可逆的變化。

細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥的消毒及布局

a.保持細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥內(nèi)的整潔有序，將所有物品置于直視范圍內(nèi)。

b.向放入通風(fēng)櫥內(nèi)的所有物品噴灑70%乙醇，擦拭清潔進(jìn)行消毒。

c.在通風(fēng)櫥中部開闊處放置細(xì)胞培養(yǎng)容器；移液器置于右前方易于取用；試劑和培養(yǎng)基置于右后方便于吸??；試管架置于中后部；小型容器置于左后部用于盛放廢液。

培養(yǎng)瓶/皿等物品的無菌操作

無菌培養(yǎng)瓶、試劑瓶、培養(yǎng)皿等物品使用時(shí)方可揭開蓋子，不得將其開放暴露于環(huán)境中，操作完成后盡快蓋上蓋子，取下蓋子時(shí)應(yīng)將蓋子開口朝下放在工作臺面上。

進(jìn)行無菌操作時(shí)不要說話、唱歌或吹口哨。盡快完成實(shí)驗(yàn)，以盡量避免污染。

細(xì)胞培養(yǎng)中可能的污染物

細(xì)胞培養(yǎng)污染物主要分為兩類

a.化學(xué)污染物,如培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和去污劑。

b.生物污染物，如細(xì)菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細(xì)胞系的交叉污染。

可通過充分了解污染源以及采用良好的無菌技術(shù)，降低污染發(fā)生的頻率和嚴(yán)重程度。

細(xì)胞培養(yǎng)污染篩查

細(xì)胞被污染了途徑有以下幾個(gè)

a.空氣是微生物傳播的最主要途徑，操作時(shí)盡量避免說話、咳嗽、打噴嚏；

b.使用的培養(yǎng)器械及器皿清洗消毒；

c.培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞時(shí)，操作不規(guī)范，可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染；

d.血清有問題，可能血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒污染；

e.原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本。

交叉污染的確認(rèn)

交叉污染雖不如微生物污染普遍，但與HELA細(xì)胞及其他生長迅速的細(xì)胞系間廣泛的交叉污染是個(gè)明確的問題，會(huì)造成嚴(yán)重后果。

從聲譽(yù)好的細(xì)胞庫獲取細(xì)胞系、定期檢查細(xì)胞系性質(zhì)及采用良好的無菌技術(shù)有助于避免交叉污染。

通過DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可確認(rèn)有無交叉污染。

細(xì)胞換液注意事項(xiàng)

為細(xì)胞換液時(shí)，要沿著培養(yǎng)瓶的一側(cè)輕輕地加入，而不是直接加到細(xì)胞中，以免損傷細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞株較為脆弱時(shí)尤其需要注意。

使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體時(shí)，每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。

細(xì)胞傳代的時(shí)間把握

當(dāng)細(xì)胞呈指數(shù)增殖，貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞已占據(jù)所有可用基質(zhì)、沒有擴(kuò)增空間，或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞已超過培養(yǎng)基質(zhì)所支撐的能力，無法進(jìn)一步生長時(shí)，細(xì)胞增殖速度將大大降低甚至停止。

細(xì)胞培養(yǎng)中使用抗生素的注意事項(xiàng)

細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不應(yīng)長期使用抗生素，因?yàn)檫B續(xù)使用抗生素會(huì)促進(jìn)抗生素耐藥性細(xì)胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。抗生素只能作為對付污染的最后手段短期使用，并盡快撤除。

如果長期使用抗生素，則應(yīng)同時(shí)進(jìn)行無抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對照。

細(xì)胞凍存的必要性

連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系容易發(fā)生遺傳漂變，有限細(xì)胞系最終會(huì)發(fā)生衰老，所有培養(yǎng)的細(xì)胞都易受到微生物污染，即使運(yùn)轉(zhuǎn)情況好的實(shí)驗(yàn)室也會(huì)遇到設(shè)備故障的問題。

由于已建立的細(xì)胞系是一種寶貴資源，更換細(xì)胞系成本高昂，而且耗費(fèi)時(shí)間，因此，必須將其冷凍起來，長期保存。

細(xì)胞凍存的事項(xiàng)

應(yīng)在細(xì)胞濃度高的情況下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)凍存，并且細(xì)胞傳代的次數(shù)盡可能少。

在凍存前確?；罴?xì)胞的百分比至少為90%。

請注意，最佳凍存條件取決于所用細(xì)胞系。

凍存和復(fù)蘇過程對大多數(shù)細(xì)胞都會(huì)造成不利影響，因此不要通過渦旋震蕩或者用。