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原理
用機械法從細胞單層分離細胞，在 27°C 條件下和懸浮狀態(tài)下進行擴增培養(yǎng)。
材料與儀器
Sf9細胞 二甲基亞砜 Pluronic F68
生長培養(yǎng)液
培養(yǎng)瓶 旋轉培養(yǎng)瓶和磁力攪拌器 27°C培養(yǎng)箱
步驟
常規(guī)維持培養(yǎng)
1. 通過刮取法或用培養(yǎng)液沖洗細胞（( ATCC # CRL-1711 ) 或從甘藍環(huán) Trichoplusia ni 獲得的細胞系（Tn 368 或 BTI-TN-5B1-4，也稱 “High Five ”，可從 Invitrogen 購買））法使細胞從培養(yǎng)瓶中脫落，或者利用在旋轉瓶中懸浮生長的細胞。
2. 用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞，通過用臺盼藍或萘黑染色檢査細胞的活力。
3. 以 0.5~1×106 個/ml 活細胞密度將細胞種植于旋轉培養(yǎng)瓶內(nèi)，每 500 ml 旋轉瓶內(nèi)注入 20~100 ml 細胞懸液。
4. 在 20~28°C 條件下培養(yǎng)細胞，以 37°C 為佳。
5. 每 48~72 h 或當細胞密度為 4~5×106 個/ml 時，將細胞稀釋至 0.5~1×106 個/ml。
6. 每 3~4 周將細胞移入潔凈的培養(yǎng)瓶。
7. 如果細胞群聚集，稍微加快攪拌速度，并加入表面活性劑 Pluronic F-68 [ 0.5%~1.0% (v / v ) ]，以降低剪切力。
凍存細胞
1. 計數(shù)細胞，離心（1000 rpm ，約 200 g，5 min )。
2. 用 10% DMSO ( 用 FBS 配制）混懸細胞，密度為 1×107 個/ml。
3. 將細胞分裝入凍存管，然后將凍存管放在冰上 1 h。
4. 將凍存管裝入苯乙烯泡沫容器。
5. 在 -70°C 條件下將凍存管緩慢冷凍過夜（約 1°C /min )。
6. 將凍存管移入液氮凍存器中。
7. 使凍存的細胞復蘇時，將凍存管在 37°C 迅速融化。如果細胞以液相儲存，在融化加蓋容器中的細胞時應注意避免因凍存管破裂而導致受傷的危險。
8. 將細胞移入含 5 ml 培養(yǎng)液的 25 cm2 培養(yǎng)瓶。輕拍培養(yǎng)瓶，以便均勻地分散細胞。
9. 2~3 h 后吸去培養(yǎng)液。當大多數(shù)細胞貼壁時，加入 5 ml 新鮮培養(yǎng)液。
10. 在分離前將細胞培養(yǎng) 2~3 天，使細胞恢復。然后按前述方法，將細胞移入攪拌培養(yǎng)瓶或更大的塑料瓶。
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