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原理
溫度高時(shí)瓊脂呈液態(tài)，但在37℃ 時(shí)成凝膠狀態(tài)，細(xì)胞懸浮在溫暖的瓊脂凝膠培養(yǎng)基中，待瓊脂形成凝膠后進(jìn)行培養(yǎng)，形成散在集落，很容易分離。
材料與儀器
Noble瓊脂 Difco 胎牛血清
兩倍濃度培養(yǎng)基 生長(zhǎng)培養(yǎng)基 無菌超純水 無菌錐形瓶 吸管 通用容器 培養(yǎng)皿 水浴 三角瓶 托盤 電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 本生煤氣噴燈
步驟
1. 在培養(yǎng)皿底皿側(cè)面編號(hào)或做好標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放在托盤中，很方便。
2. 準(zhǔn)備含 40 % FBS 的 2× 培養(yǎng)基（即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培養(yǎng)基配 2× 培養(yǎng)基，取半量所需終液量，加兩倍濃度的血清），保持 37℃。
3. 稱取 1.2 g 瓊脂。
4. 分別在無菌錐形瓶和另一個(gè)無菌瓶中加 100 ml 無菌 UPW。將 1.2 g 瓊脂放人錐形瓶中，蓋好，煮沸 2 min 。另一種方法是，提前高溫滅菌瓊脂。但若已保存起來，使用時(shí)仍需煮沸溶解或微波爐融化備用。
5. 將煮沸過的瓊脂和有 UPW 的瓶放到 55°C 水浴中。
6. 2× 培養(yǎng)基和 1.2 % 瓊脂等量混合制備 0.6 % 瓊脂底層，保持 37°C 。如果需要任何的生長(zhǎng)因子、激素或其他添加物，應(yīng)在此時(shí)添加至底層瓊脂培養(yǎng)基（生長(zhǎng)培養(yǎng)基，1×，用于細(xì)胞稀釋）內(nèi)。
7. 在培養(yǎng)皿中加人 1 ml 0.6 % 的瓊脂培養(yǎng)基，晃勻，確保培養(yǎng)基覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿底。置于室溫定型。
8. 制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。
9. 準(zhǔn)備 0.3% 瓊脂培養(yǎng)基，保持 37°C 。此培養(yǎng)基可以用 37°C 的 2× 培養(yǎng)基、55°C 的 1.2 % 瓊脂和 55°C 的 UPW 以 2:1:1 的比例混合制備。
10. 制備以下稀釋濃度的細(xì)胞，使細(xì)胞的最大濃度為 1×105 /ml。
(a)1×105 /ml
(b)將 1×105 /ml 稀釋 3 倍成 3.3×104 /ml
(c)將 3.3×104 /ml 稀釋 3 倍成 1.1×104 /ml
(d)將 1.1×104 /ml 稀釋 3 倍成 3.7×103 /ml
11. 將四種稀釋液的濃度分別標(biāo)在 4 個(gè)小玻璃瓶或試管上，從每種稀釋液中吸出 40 μl，包括 1×105 /ml 細(xì)胞液，分別放入相應(yīng)容器內(nèi) 37°C 加 4 ml 0.3% 瓊脂培養(yǎng)基，混勻，再從每個(gè)容器（通用容器，小玻璃瓶或離心管，稀釋細(xì)胞用）中吸出 3 個(gè) 1 ml 分別加在相應(yīng)的三個(gè)培養(yǎng)皿上。最終濃度如下：
(a)1×103 /ml/皿
(b)330 /ml/皿
(c)110 /ml/皿
(d)37 /ml/皿
加細(xì)胞之前， 確保上層瓊脂培養(yǎng)基有足夠的時(shí)間冷卻至 37°C 。
12. 待培養(yǎng)皿中的溶液在室溫下形成凝膠狀態(tài)。
13. 將培養(yǎng)皿放置在一個(gè)帶蓋的清潔塑料盒中，37°C 加濕溫箱中培養(yǎng) 10 天。
注意事項(xiàng)
準(zhǔn)備培養(yǎng)基和細(xì)胞之前，先算出細(xì)胞稀釋度，在培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記，檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞系的克隆形成率時(shí)，為每種稀釋度的細(xì)胞分別準(zhǔn)備3 個(gè)培養(yǎng)皿。每個(gè)3. 5 cm 培養(yǎng)皿適宜接種的細(xì)胞數(shù)是1000、333、111和 37 個(gè)。也就是依次 3 倍的稀釋細(xì)胞懸液。如果需要加入生長(zhǎng)因子、激素或其他添加劑，應(yīng)加在下層的 0.6 % 瓊脂中。
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