骨缺損指骨的結(jié)構(gòu)完整性被破壞，是臨床常見病?；诟杉毎墓墙M織工程技術(shù)是再生骨缺損的一種有前途的策略。骨組織工程的基本概念是通過結(jié)合生長因子、合適的支架和特定的成骨細胞或其祖細胞來產(chǎn)生新的骨。然而，骨組織是由幾種細胞類型及其周圍的細胞外基質(zhì)形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。因此，了解每種細胞類型之間的關(guān)系以達到成功的骨再生非常重要。由于這些原因，研究人員已轉(zhuǎn)向共培養(yǎng)研究以增強骨骼再生。

間充質(zhì)干細胞（MSCs）是組織工程中細胞治療的重要來源。間充質(zhì)干細胞通過細胞與細胞間的直接接觸誘導(dǎo)直接效應(yīng)，并分泌趨化因子和細胞因子用于旁分泌和自分泌功能，在組織再生中產(chǎn)生營養(yǎng)支持。內(nèi)皮祖細胞（EPCs）具有分化為成熟內(nèi)皮細胞的能力，并且EPCs在血管生成中的作用已在體外和體內(nèi)得到廣泛研究。EPCs能夠促進宿主骨缺損的再生，這可能是血管形成增加和參與骨愈合的其他細胞/分子因素的結(jié)果。EPCs與MSCs的結(jié)合對細胞增殖和分化有深遠的影響。研究表明，EPCs和MSCs的共同培養(yǎng)可顯著改善骨形成，但MSCs和EPCs在成骨中的關(guān)系尚未闡明。

因此，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院口腔科、中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院的一項研究在共培養(yǎng)實驗中使用MSCs和EPCs研究它們的成骨相互作用，鑒定驅(qū)動這種相互作用的基因表達變化，確定EPCs如何影響MSCs的成骨分化，并研究了絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路在成骨分化中的參與。

首先，內(nèi)皮祖細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)分離鑒定后，設(shè)立兩種細胞共培養(yǎng)的實驗組和骨髓間充質(zhì)干細胞單獨培養(yǎng)的對照組。然后鑒定了成骨誘導(dǎo)過程中EPCs-MSCs 共培養(yǎng)與MSCs單培養(yǎng)組的差異調(diào)控基因。差異表達基因的KEGG富集分析表明，許多信號通路，包括MAPK，ECM-受體相互作用，TNF，PI3K-Akt和HIF-1，都受到共培養(yǎng)的EPCs的調(diào)控。在這些通路中，MAPK主要受到與EPCs共培養(yǎng)的影響。

接下來，為了研究EPCs對MSCs分化的影響，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)MSCs。結(jié)果表明，當(dāng)與EPCs共培養(yǎng)時，MSCs在分化方面表現(xiàn)不同。當(dāng)MSCs 與EPCs共培養(yǎng)時，觀察到ALP（堿性磷酸酶）增加。實驗在第1天、第7天和第14天測量ALP活性，數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)MSCs與EPCs共培養(yǎng)時，ALP活性增加，與第1天和第7天相比，第14天時ALP活性最高，EPCs在7 和14 天顯著提高了MSCs的ALP活性，分別提高了14.91% 和30.52%（圖1 a）。

在第14天進行qRT-PCR定量成骨基因表達，包括Runx2、OPN和BSP，以研究EPCs對MSCs分化的影響。結(jié)果表明，與單層間充質(zhì)干細胞相比，EPCs在共培養(yǎng)的MSCs中顯著提高了42.16% 的OPN mRNA表達，BSP和Runx2 mRNA水平在共培養(yǎng)的MSCs中也分別顯著提高了29.87% 和34.52%（圖1 b）。

這些數(shù)據(jù)表明，EPCs增加間接共培養(yǎng)的MSCs的成骨基因表達。

圖1   EPCs促進MSCs的成骨分化。

（a）在誘導(dǎo)成骨分化后第7、14和21天通過ALP染色確定成骨分化。（b）在成骨分化誘導(dǎo)后第14天通過qRT-PCR測量成骨基因OPN，BSP和Runx2的表達。（c）EPCs促進MSCs的MAPK信號通路的激活，通過蛋白質(zhì)印跡檢查p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK表達。（d）通過免疫印跡法測定p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK的蛋白質(zhì)水平，β-肌動蛋白作為內(nèi)對照。

此外，qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法用于評估MAPK通路是否參與成骨。與單獨培養(yǎng)的MSCs相比，與 EPCs共培養(yǎng)的MSCs中的p38磷酸化水平顯著上調(diào)。然而，JNK和ERK1/2磷酸化水平?jīng)]有顯著改變（圖1 c、d）。qRT-PCR數(shù)據(jù)顯示，在MSCs-EPCs共培養(yǎng)組中，p38基因表達顯著上調(diào)75.27%。在MSCs-EPCs共培養(yǎng)組中，TAB1和MKK6基因表達也顯著上調(diào)116.93% 和112.51%（圖1 e）。這些數(shù)據(jù)表明，EPCs 促進 TAB1、MKK6 和 p38 基因表達以及 p38 磷酸化。

為了進一步研究EPCs是否通過MAPK信號通路促進MSCs的成骨分化，實驗使用了p38信號抑制劑SB 203580，ERK信號抑制劑FR180204和 JNK 抑制劑 SP600125 來評估共培養(yǎng)的 MSCs 中 MAPK 信號通路和成骨分化的變化。用特異性通路抑制劑處理后，測定p38、ERK1/2、JNK的蛋白質(zhì)及其磷酸化蛋白水平和MSCs的成骨能力。結(jié)果表明，通過SB203580、FR180204和 SP600125處理，p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平顯著降低（圖2 a、b）。ALP實驗和茜素紅染色進一步證實了MAPK信號通路對MSCs成骨分化能力的調(diào)控。結(jié)果表明，SB203580顯著降低了ALP水平和鈣結(jié)節(jié)形成（圖2 c-f）。這些數(shù)據(jù)表明，EPCs通過促進p38 MAPK信號通路激活來參與MSCs 的成骨分化。

圖2   EPCs通過促進MAPK磷酸化誘導(dǎo)成骨分化。

（a）MSCs 用p38通路抑制劑SB203580、ERK通路抑制劑FR 180204或JNK通路抑制劑SP600125預(yù)處理，然后與EPCs共培養(yǎng)，并通過免疫印跡檢查p38、p-p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK和JNK的蛋白質(zhì)水平。（b）通過免疫印跡法檢測p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK和JNK的相對蛋白水平，β-肌動蛋白作為內(nèi)對照。（c）通過ALP染色確定成骨分化。（d）鈣結(jié)節(jié)的形成通過茜素紅染色測定。（e）相對ALP活性。（f）相對礦化水平。

實驗證明了p38信號通路在共培養(yǎng)的MSCs中起著重要作用。在此觀察之后，實驗最后使用p38 siRNA沉默進一步探索了p38MAPK在促進MSCs成骨分化中的功能。p38 siRNA用于阻止p38MAPK通路激活。結(jié)果觀察到p38 siRNA添加到細胞后，p38磷酸化水平顯著降低。然而，p-JNK和p-ERK1/2表達水平?jīng)]有顯著改變（圖3 a、b）。接下來，研究了p38 siRNA對MSCs成骨分化的影響。數(shù)據(jù)顯示，p38沉默顯著降低了Runx2、OPN、BSP和Col I蛋白表達水平（圖3 c、d）。一致地，ALP水平和鈣結(jié)節(jié)形成均受到p38沉默的抑制（圖3 e-h）。因此，EPCs通過激活p38 MAPK信號通路對MSCs的成骨分化具有積極影響。

圖3   p38 MAPK信號通路參與MSCs成骨分化。

（a）用siRNA-p38轉(zhuǎn)染MSCs，并通過免疫印跡檢查p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK和JNK的蛋白表達，β-肌動蛋白作為內(nèi)對照。（b）p-p38、p38、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK 和 JNK 相對蛋白質(zhì)水平的密度測定法。（c）免疫印跡法檢測OPN、BSP、Runx2 和 Col I 的蛋白表達。（d）OPN、BSP、Runx2和Col I相對蛋白質(zhì)水平的密度測定。（e）通過ALP染色確定成骨分化。（f）相對ALP活性。（g）通過茜素紅染色形成鈣結(jié)節(jié)。（h）相對礦化水平。

總之，這項研究的結(jié)果支持EPCs可以在體外增強MSCs成骨分化的觀點。EPCs對 MSCs的分化和成骨具有深遠的影響，EPCs顯著促進了MSCs 的成骨基因表達和蛋白質(zhì)合成。ALP活性和鈣結(jié)節(jié)形成也顯著增加。EPCs的外泌體或旁分泌因子影響MSCs的生物學(xué)功能，激活p38MAPK通路可能是增強MSCs成骨分化的關(guān)鍵。對細胞相互作用的進一步了解對于理解體外細胞動力學(xué)將是無價的，最終有助于更合理的組織工程策略。

參考文獻：Xu C, Liu H, He Y, Li Y, He X. Endothelial progenitor cells promote osteogenic differentiation in co-cultured with mesenchymal stem cells via the MAPK-dependent pathway. Stem Cell Res Ther. 2020 Dec 11;11(1):537. doi: 10.1186/s13287-020-02056-0. PMID: 33308309; PMCID: PMC7731475.

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