實(shí)驗(yàn)名稱：多功能明膠復(fù)合水凝膠的制備及體外構(gòu)建工程化心肌組織的研究

　　研究方向：生物醫(yī)學(xué)

　　測(cè)試目的：

　　制備一種基于GelMA的三維各向異性的電磁功能復(fù)合水凝膠支架（GelMA-PDA-rGO-Fe3O4），由Fe3O4納米顆粒修飾的PDA-rGO（PDA-rGO-Fe3O4）電磁雙功能納米復(fù)合物在直流磁場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下定向固化。2D和3D細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各向異性結(jié)構(gòu)有利于表面心肌細(xì)胞的定向生長和搏動(dòng)。由于該復(fù)合水凝膠同時(shí)具有導(dǎo)電性和磁性，所以進(jìn)行直流磁場(chǎng)和交流磁場(chǎng)磁刺激研究。結(jié)果表明交流磁場(chǎng)刺激和電刺激一樣也能促進(jìn)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)育完整、提高心肌細(xì)胞的搏動(dòng)速率和頻率，以及上調(diào)心肌特異性蛋白和成熟相關(guān)基因的表達(dá)。基于GelMA-PDA-rGO-Fe3O4構(gòu)建的ECT在長時(shí)間培養(yǎng)中表現(xiàn)出類似蝴蝶飛行的搏動(dòng)行為，可以作為可視化藥物篩選的生物驅(qū)動(dòng)器。總的來說，多功能PDA-rGO-Fe3O4復(fù)合水凝膠將是一種優(yōu)異的支架材料，在心肌修復(fù)、藥物篩選和疾病模型等領(lǐng)域中有潛在的應(yīng)用。

　　測(cè)試設(shè)備：ATA-304功率放大器、信號(hào)發(fā)生器、helmholtz線圈、載有細(xì)胞的孔板、水凝膠支架。

　　實(shí)驗(yàn)過程：

　　實(shí)驗(yàn)之前先進(jìn)行電磁功能PDA-rGO-Fe3O4納米復(fù)合物的制備和各向異性的GelMA-PDA-rGO-Fe304電磁復(fù)合水凝膠的制備，然后進(jìn)行心肌細(xì)胞的提取與2D、3D接種和培養(yǎng)。再進(jìn)行心肌細(xì)胞的電刺激和磁刺激處理。

　　圖：靜態(tài)磁場(chǎng)發(fā)生裝置實(shí)物圖

　　1、直流磁場(chǎng)刺激

　　心肌細(xì)胞的直流磁場(chǎng)刺激處理是在直流磁場(chǎng)發(fā)生裝置中進(jìn)行的，裝置示意圖如上述圖4.1所示。將載有細(xì)胞的孔板放置于均勻磁場(chǎng)范圍內(nèi)，當(dāng)直流電流為0.87A時(shí)，產(chǎn)生的直流磁場(chǎng)強(qiáng)度為1.47mT，和理論值1.5mT基本一致。

　　2、交流磁場(chǎng)刺激

　　顧名思義，心肌細(xì)胞的交流磁場(chǎng)刺激處理是在交流磁場(chǎng)發(fā)生裝置中進(jìn)行的，交變磁場(chǎng)發(fā)生裝置示意圖如圖4.2所示。與直流磁場(chǎng)發(fā)生裝置不同的是，交變磁場(chǎng)是通過信號(hào)發(fā)生器和功率放大器兩者聯(lián)合輸出放大后的正弦波電流，驅(qū)動(dòng)線圈產(chǎn)生交變磁場(chǎng)。當(dāng)施加的正弦波頻率為5Hz，電流為1A時(shí)，磁場(chǎng)強(qiáng)度為1mT左右。心肌細(xì)胞先靜態(tài)培養(yǎng)3天，再放置到均勻的交變磁場(chǎng)中，連續(xù)持續(xù)刺激5天。撤去磁場(chǎng)后再繼續(xù)靜態(tài)培養(yǎng)7天。無磁場(chǎng)刺激的實(shí)驗(yàn)組作為陽性對(duì)照，GelMA-Fe3O4作為其中陰性對(duì)照。

　　圖：交變磁場(chǎng)發(fā)生裝置示意圖

　　3、施加交變磁刺激對(duì)心肌細(xì)胞的功能影響

　　利用GelMA-PDA-rGO-Fe3O4磁性復(fù)合水凝膠結(jié)合外部磁刺激來構(gòu)建成熟的ECT，用于以后心臟貼片和藥物篩選的研究。

　　圖4.17：用于心肌細(xì)胞磁刺激的交變磁場(chǎng)刺激裝置。（A）促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟的磁刺激方案。（B）磁刺激裝置示意圖，該裝置包括helmholtz線圈、信號(hào)發(fā)生器和功率放大器。磁刺激且培養(yǎng)到15天，各組心肌細(xì)胞（C）在兩幀之間以紅色運(yùn)動(dòng)矢量表示的細(xì)胞收縮矢量圖和（D）相應(yīng)的搏動(dòng)信號(hào)記錄曲線。標(biāo)尺：500μm。各組相應(yīng)的（E）自發(fā)搏動(dòng)頻率和（F）搏動(dòng)速率統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)。*p<0.05和**p<0.01。

　　如圖4.17A所示，將新生大鼠心肌細(xì)胞接種到水凝膠支架上，先靜態(tài)培養(yǎng)3天，然后放置于交變磁場(chǎng)裝置中（磁感應(yīng)強(qiáng)度為1T，圖4.17B）持續(xù)刺激5天，在第8天時(shí)撤去磁場(chǎng)，再靜態(tài)培養(yǎng)一周，總計(jì)15天。圖4.17C和4.17D展示了刺激組和對(duì)照組心肌細(xì)胞培養(yǎng)第15天時(shí)的搏動(dòng)行為由于各向異性GelMA-PDA-rGO-Fe3O4復(fù)合水凝膠支架易于對(duì)稱性折疊，因此其表面的心肌細(xì)胞以相同的方向同步收縮；而GeMA組和各向同性復(fù)合組上的心肌細(xì)胞由于支架材料呈現(xiàn)非對(duì)稱性折疊，因此其表面的心肌細(xì)胞以任意的方向同步跳動(dòng)。此外，刺激復(fù)合組（各向異性和各向同性復(fù)合組）中的平均搏動(dòng)頻率（BPM）和靜態(tài)培養(yǎng)第8天一樣，均高于GelMA刺激組。如圖4.17E所示，各組的平均BPM分別為44±2（GelMA組）、60±3（各向同性復(fù)合組）和76±4（各向異性復(fù)合組），與培養(yǎng)第8天的平均BPM值基本一致，說明磁刺激對(duì)于心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率影響較小。

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

　　經(jīng)過磁刺激和長時(shí)間的培養(yǎng)，各組心肌細(xì)胞的搏動(dòng)速率均顯著增加，達(dá)到了mm/s，因此肉眼可見生成的心肌組織自發(fā)地搏動(dòng)。如圖4.17D和4.17F所示，定量的收縮速率（GelMA組、各向同性組和各向異性組分別為4.070.18mm/s9.48+0.46mm/s和12.40+0.63mm/s）和舒張速率（GelMA、各向同性組和各向異性組分別為2.36+0.11mm/s，3.27+0.16mm/s和11.970.62m/s）。因此，我們的結(jié)果表明由PDA-rGO-Fe304納米復(fù)合物引起的支架3D各向異性結(jié)構(gòu)和磁場(chǎng)刺激的協(xié)同效應(yīng)，促進(jìn)了心肌細(xì)胞AP的快速傳遞和心肌細(xì)胞間地電耦合，驅(qū)動(dòng)生成成熟的ECTS。

　　安泰ATA-304功率放大器：

　　圖：ATA-304功率放大器指標(biāo)參數(shù)

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　　本文實(shí)驗(yàn)案例參考自知網(wǎng)論文《多功能明膠復(fù)合水凝膠的制備及體外構(gòu)建工程化心肌組織的研究》