MET基因位于人類(lèi)基因組的7q31號(hào)染色體上，跨越約125kbDNA，包含21個(gè)外顯子和20個(gè)內(nèi)含子。MET被編碼為前體，通過(guò)其a和b亞基之間的蛋白水解切割被修飾成成熟蛋白質(zhì)。 成熟的MET蛋白由一個(gè)小的a亞基(50kDa)和一個(gè)較大的b  (145kDa)亞基組成，通過(guò)二硫鍵連接在一起。一個(gè)a亞基和b亞基的一部分共同構(gòu)成異二聚體蛋白的胞外區(qū)，而b亞基的其余部分構(gòu)成跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。

MET的細(xì)胞外成分包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域。N端Sema(Sema-phorin)是最大的結(jié)構(gòu)域，包含500個(gè)殘基，包含a和b亞基的一部分。該結(jié)構(gòu)域?qū)τ贛ET的配體結(jié)合、二聚化和激活至關(guān)重要。Sema結(jié)構(gòu)域之后是叢蛋白-信號(hào)蛋白-整合素(PSI)結(jié)構(gòu)域，包含四個(gè)二硫鍵，這對(duì)于配體結(jié)合受體的正確定位至關(guān)重要。PSI結(jié)構(gòu)域通過(guò)免疫球蛋白-叢蛋白-轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域連接到MET的跨膜螺旋。受體的細(xì)胞內(nèi)部分包括近膜(JM)結(jié)構(gòu)域、酪氨酸激酶(TK)催化結(jié)構(gòu)域和C末端多功能?？课稽c(diǎn)。其配體肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)（也稱(chēng)為分散因子）的結(jié)合對(duì)于激活激酶活性至關(guān)重要。HGF是迄今為止已知的MET受體配體，并以高親和力與受體結(jié)合。

Fig1.MET蛋白的結(jié)構(gòu)

HGF與MET結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化，導(dǎo)致激酶結(jié)構(gòu)域中細(xì)胞內(nèi)殘基Y1234和Y1235自磷酸化，隨后在激酶結(jié)構(gòu)域外的C端磷酸化另外兩個(gè)酪氨酸殘基Y1349和Y1356。C末端殘基的磷酸化導(dǎo)致對(duì)接位點(diǎn)的形成，隨后銜接子和效應(yīng)蛋白，如GRB2（生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2）、GAB1（GRB2相關(guān)結(jié)合蛋白1）和SHC（含Src同源2結(jié)構(gòu)域），與?？课稽c(diǎn)結(jié)合，觸發(fā)下游信號(hào)傳導(dǎo)。

2005年報(bào)道了NSCLC中MET Ex14的跳躍 。內(nèi)含子13的3' 剪接位點(diǎn)或內(nèi)含子14的5 '末端剪接位點(diǎn)的替換或缺失導(dǎo)致MET Ex14跳躍。在MET Ex14的剪接點(diǎn)處或剪接點(diǎn)附近發(fā)生的這種體細(xì)胞改變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物中外顯子14的丟失和MET蛋白的合成以及JM結(jié)構(gòu)域中47個(gè)氨基酸的框內(nèi)缺失（包括殘基Y1003)消融CBL介導(dǎo)的受體泛素化和降解。因此，MET Ex14跳躍導(dǎo)致MET蛋白水平升高，這可以驅(qū)動(dòng)促進(jìn)腫瘤發(fā)展的下游信號(hào)通路的激活。

Fig 2. MET Ex14跳躍的機(jī)理

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告，在非小細(xì)胞肺癌中常見(jiàn)的導(dǎo)致MET Ex14跳躍的突變有如下幾種：

Fig 3. 常見(jiàn)導(dǎo)致MET Ex14跳躍的突變

同時(shí)在眾多的其他癌種中也發(fā)現(xiàn)很多，大約 3–4% 的 NSCLC 具有MET Ex14改變。在組織學(xué)亞型中，  MET Ex14跳躍改變常見(jiàn)于肉瘤樣癌 (4.9–31%)，69–72腺鱗癌 (4–8%)、腺癌 (3–4%) 和鱗狀細(xì)胞癌 (2%)。此外，在腺癌中，主要的亞型是腺泡型 (35-52.9%) 或?qū)嵭詠喰?(35.3-53%)。臨床上，  METEx14跳躍異常多見(jiàn)于高齡患者。

一般而言，基于DNA和RNA的分子檢測(cè)是檢測(cè)METex14改變的方法。基于DNA的測(cè)序分析可以檢測(cè)MET改變，例如剪接位點(diǎn)的插入、缺失、點(diǎn)突變或重復(fù)，這些改變可能導(dǎo)致外顯子14跳躍。然而，METEx14跳躍與剪接位點(diǎn)中超過(guò)120個(gè)報(bào)告的序列變異有關(guān)，這使得僅使用基于DNA的檢測(cè)來(lái)檢測(cè)這些突變具有挑戰(zhàn)性。因此，對(duì)RNA轉(zhuǎn)錄本的分析可以驗(yàn)證外顯子13和15之間的融合。在理想情況下，基于DNA和RNA的檢測(cè)可相互補(bǔ)充，以可靠地檢測(cè)METEx14改變。

Fig 4. 常見(jiàn)針對(duì)DNA和RNA檢測(cè)技術(shù)來(lái)識(shí)別MET Ex14跳躍的方法

科佰生物利用基因編輯的方法，成功獲得多種MET Ex14跳躍的標(biāo)準(zhǔn)品，表現(xiàn)為在DNA層面出現(xiàn)剪切變異，在RNA層面出現(xiàn)14外顯子的缺失，部分產(chǎn)品羅列如下：

表1. 部分MET Ex14跳躍突變的產(chǎn)品

檢測(cè)數(shù)據(jù)如下（以c.3028+1_c.3028+9del為例）

AI-Edigene® MET Splice Site Mutation（c.3028+1_c.3028+9del）Reference Standard

Fig 5. DNA的sanger測(cè)序顯示c.3028+1_c.3028+9del

Fig 6. RNA的sanger測(cè)序發(fā)生14外顯子的缺失

Fig 7. DNA的ddPCR檢測(cè)，顯示突變頻率為*

Fig 8. RNA的ddPCR檢測(cè)，顯示拷貝數(shù)為1315.07 copies/ng

如上數(shù)據(jù)可知，不僅僅在DNA層面發(fā)生了剪切變異，在RNA層面也發(fā)生了變異，而且根據(jù)ddPCR的拷貝數(shù)數(shù)據(jù)顯示，MET表達(dá)也大大增加了。

科佰生物在使用基因編輯技術(shù)定制定點(diǎn)突變、插入、缺失、融合上有豐富的經(jīng)驗(yàn)，歡迎大家一起溝通討論。