做ELISA試劑盒的經(jīng)驗總結(jié):

1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時，師兄都嚴格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白，對于sheng物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被，我把方法簡要的列出如下:①親和素sheng物素:先親和素先包被載體，加入sheng物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。②脂類物質(zhì):可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA試劑盒板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。

2、包被液的選擇，ELISA試劑盒一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于試驗的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。應注意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用，這種物理吸附是非特異性的，ELISA試劑盒受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有堅固的理論外也要實踐，看一下終可不可以應用到自己試驗當中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。

3、封閉：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA試劑盒后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA；10%的小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用（5%－10％）；還有一些稀有用到的各種動物血清（主要為了排除相似蛋白干擾）和酪蛋白等等。但終選用什么，要依據(jù)試驗具體來實踐。