手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號(hào)：chem17
掃碼關(guān)注視頻號(hào)
原理
ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即：用于檢測(cè)抗體的間接法、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
材料與儀器
BSA 血清
碳酸鹽緩沖液 PBS 蒸餾水 磷酸棗檸檬酸 四甲基聯(lián)苯胺
塑料板 ELISA檢測(cè)儀 加樣器 滴頭 毛巾 洗滌瓶 燒杯 玻璃棒 試管 吸管 量筒 冰箱 孵育箱
碳酸鹽緩沖液 PBS 蒸餾水 磷酸棗檸檬酸 四甲基聯(lián)苯胺
塑料板 ELISA檢測(cè)儀 加樣器 滴頭 毛巾 洗滌瓶 燒杯 玻璃棒 試管 吸管 量筒 冰箱 孵育箱
步驟
一、用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法
2. 加樣
加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）。
3. 加酶標(biāo)抗體
于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1 ml。37 ℃孵育0.5～1 小時(shí)，洗滌。
4. 加底物液顯色
于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 ml，37 ℃10～30 分鐘。
5. 終止反應(yīng)
于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸0.05 ml。
6. 結(jié)果判定
（1）可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果。
反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。
（2）可測(cè)OD值
在ELISA檢測(cè)儀上，于450 nm（若以ABTS顯色，則410 nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。
二、用于檢測(cè)未知抗體的間接法
1. 用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10 μg/ml，每孔加0.1 ml，4 ℃過(guò)夜。次日洗滌3 次。
1. 包被
用0.05 M PH9 牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 ml，4 ℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。
用0.05 M PH9 牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 ml，4 ℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。
2. 加樣
加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）。
3. 加酶標(biāo)抗體
于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1 ml。37 ℃孵育0.5～1 小時(shí)，洗滌。
4. 加底物液顯色
于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 ml，37 ℃10～30 分鐘。
5. 終止反應(yīng)
于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸0.05 ml。
6. 結(jié)果判定
（1）可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果。
反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。
（2）可測(cè)OD值
在ELISA檢測(cè)儀上，于450 nm（若以ABTS顯色，則410 nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。
二、用于檢測(cè)未知抗體的間接法
1. 用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10 μg/ml，每孔加0.1 ml，4 ℃過(guò)夜。次日洗滌3 次。
2. 加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1 ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1小時(shí)，洗滌。（同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照）
3. 于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗體）0.1 ml，37 ℃孵育30-60 分鐘，洗滌，最后一遍用DDW洗滌。
4. 其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
注意事項(xiàng)
1. 正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2. 在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括
（1）固相載體的選擇
許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
（2）包被抗體（或抗原）的選擇
將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好，吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4 ℃18～24 小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10 μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10 μg/ml。
（3）酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇
首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定。然后再固定其它條件或采取“方陣法“（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
（4）酶的底物及供氫體的選擇
對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
2. 在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括
（1）固相載體的選擇
許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
（2）包被抗體（或抗原）的選擇
將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好，吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4 ℃18～24 小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10 μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10 μg/ml。
（3）酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇
首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定。然后再固定其它條件或采取“方陣法“（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
（4）酶的底物及供氫體的選擇
對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
深圳安培生物科技有限公司，是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、壹流的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O(shè)在廣東，服務(wù)面向全國(guó)。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供壹流的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供世界前沿水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等優(yōu)質(zhì)客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來(lái)源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用，并注明“來(lái)源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來(lái)源（非化工儀器網(wǎng)）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé)，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí)，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來(lái)源，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題，請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
采購(gòu)中心